Нейронные клеточные культуры из Aplysia для изображений с высоким разрешением роста конусов
Summary
Aplysia californica нейроны развиваются крупные конусы роста в культуре, отлично подходит для изображений с высоким разрешением роста подвижности конуса и руководство. Здесь мы приводим протокол вскрытия и покрытия нейронов Aplysia сумку клеток, а также для настройки камеры для живого изображения клетки.
Abstract
Нейронные конусы роста очень подвижные структуры на кончике аксоны, которые могут обнаружить руководством сигналы в окружающей среде и преобразовывать эту информацию в направленное движение к соответствующей клетки-мишени. Чтобы полностью понять, как руководство информация передается от поверхности клетки к основным динамическим цитоскелета сетей, нужно модель системы, пригодной для живого изображения ячейки динамики белков на высоких временным и пространственным разрешением. Типичные позвоночных конусы роста слишком малы, чтобы количественно проанализировать F-актина и микротрубочек динамику. Нейроны из морской заяц Aplysia californica в 5-10 раз больше, чем нейронов позвоночных, может быть легко хранить при комнатной температуре и очень надежный клеток для микроманипуляция и биофизических измерений. Их конусы роста очень определенных цитоплазматических регионах и хорошо описаны цитоскелета системы. Тела нейронов может быть microinjected с различными зондами для изучения роста подвижности конуса и руководство. В настоящее время протокол мы продемонстрируем процедуру вскрытия брюшной ганглий, культуре нейронов сумку клеток и создания изображений камера для живого изображения ячейки роста конусов.
Protocol
Discussion
Aplysia нейронов сумку ячейки обеспечивают бессывороточной нейронной системе культуры клеток с очень немногими без нервных клеток. Эти нейроны образуют очень большого роста конусов подходящий для решения ряда важных биологических ячейки вопросы. Нейронов сумка клетка может легко манипулировать и…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Райан Maneri (кулик-сорока Productions, LLC) для съемок нашего процедуры и Родни Макфейл (Отделение биологических наук, Purdue University) за помощь в редактировании видео вскрытия. Исследования в Suter лаборатории поддержана грантами NIH (R01 NS049233) и Bindley Bioscience центр в Университете Пердью в СУД
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
Referenzen
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
