Culturas de células neuronais de Aplysia para imagens de alta resolução de Cones de Crescimento
Summary
Neurônios Aplysia californica desenvolver cones grande crescimento na cultura que são excelentes para imagens de alta resolução da motilidade cone de crescimento e orientação. Aqui, apresentamos um protocolo para a dissecção e chapeamento de neurônios células Aplysia saco, bem como para a criação de uma câmara para imagens de células vivas.
Abstract
Cones de crescimento neuronal são as estruturas altamente móveis na ponta dos axônios que podem detectar sinais de orientação no meio ambiente e transdução esta informação em movimento direcional para a célula de destino. Para entender completamente como a informação é transmitida a orientação da superfície da célula para a dinâmica subjacente redes do citoesqueleto, um precisa de um sistema modelo adequado para imagens de células vivas da dinâmica de proteínas na resolução temporal e espacial de alta. Típicos cones de crescimento vertebrados são pequenos demais para analisar quantitativamente F-actina e dinâmica de microtúbulos. Neurônios da lebre do mar Aplysia californica são 5-10 vezes maior do que os neurônios dos vertebrados, podem ser facilmente mantidos em temperatura ambiente e são células muito robusta para micromanipulação e medidas biofísicas. Cones seu crescimento tem muito definido regiões do citoplasma e um sistema bem-descrito do citoesqueleto. Os corpos celulares neuronais podem ser microinjeção com uma variedade de sondas para estudar a motilidade cone de crescimento e orientação. No presente protocolo que demonstrar um procedimento para a dissecção do gânglio abdominal, a cultura de neurônios de células saco e criação de uma câmara de imagem para imagens de células vivas de cones de crescimento.
Protocol
Discussion
Neurônios de células Aplysia fornecer um saco de soro livre de sistema de cultura de células neuronais, com muito poucas células não-neuronais. Estes neurônios formam cones de crescimento muito grande, adequado para tratar uma série de questões importantes células biológicas. Neurônios de células saco pode ser facilmente manipulado e fotografada em temperatura ambiente durante várias horas. Usando Microscopia fluorescente Speckle (FSM) pode-se analisar quantitativamente os vários parâmetros de F-actina e polimerização dos m…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) para filmar o nosso procedimento e Rodney McPhail (Departamento de Ciências Biológicas, Purdue University) para a assistência com a edição do vídeo de dissecação. Pesquisa no laboratório Suter é suportado por concessões do NIH (NS049233 R01) e do Centro de Biociências Bindley da Universidade Purdue, a DMS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
Referenzen
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
