Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento
Summary
Aplysia californica neuronas desarrollan un gran crecimiento en los conos de la cultura que son excelentes para imágenes de alta resolución de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y de las planchas de las neuronas de células Aplysia bolsa, así como para la creación de una cámara de imágenes de células vivas.
Abstract
Conos de crecimiento neuronales son estructuras altamente móviles en la punta de los axones que pueden detectar señales de orientación en el medio ambiente y la transducción de esta información en el movimiento direccional hacia la celda de destino adecuado. Para entender completamente cómo la información se transmite a la orientación de la superficie celular a la base de redes citoesqueleto dinámico, se necesita un sistema de modelo adecuado para imágenes de células vivas de la dinámica de proteínas de alta resolución temporal y espacial. Típico de los conos de crecimiento de vertebrados son demasiado pequeños para analizar cuantitativamente la F-actina y la dinámica de los microtúbulos. Las neuronas de la liebre de mar Aplysia californica son 5-10 veces más grande que las neuronas de los vertebrados, fácilmente se puede mantener a temperatura ambiente y son células muy robusta de micromanipulación y mediciones biofísicas. Sus conos de crecimiento tienen muy definido regiones citoplásmicas y un sistema de citoesqueleto bien descritos. Los cuerpos de las células neuronales se pueden microinyección con una variedad de sondas para el estudio de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. En el presente Protocolo que demostrar un procedimiento para la disección de los ganglios abdominales, la cultura de las neuronas de células bolsa y la creación de una cámara de imágenes de imágenes de células vivas de los conos de crecimiento.
Protocol
Discussion
Aplysia neuronas de células bolsa de proporcionar un suero libre de cultivos de células neuronales del sistema con muy pocas células no neuronales. Estas neuronas forman los conos de crecimiento muy grande adecuado para hacer frente a una serie de preguntas de biología celular importante. Bolsa de neuronas de células pueden ser instrumentalizadas fácilmente y con imágenes a temperatura ambiente durante varias horas. Utilizando microscopía de fluorescencia moteado (FSM), una cuantitativa puede analizar los distintos parámetros de F-…
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Ryan Maneri (Producciones ostrero, LLC) para filmar nuestro procedimiento y Rodney McPhail (Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Purdue) para obtener ayuda con la edición de vídeo disección. La investigación en el laboratorio de Suter es apoyado por subvenciones del NIH (R01 NS049233) y el Centro Bindley Bioscience en la Universidad Purdue de DMS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
Referenzen
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
