Neuronale celkweken van Aplysia voor High-Resolution Imaging van Groei Cones
Summary
Aplysia californica neuronen ontwikkelen van grote groei van kegels in de cultuur die zijn uitstekend geschikt voor hoge-resolutie beeldvorming van groeikegel motiliteit en begeleiding. Hier presenteren we een protocol voor dissectie en plating van Aplysia zak cel neuronen, alsook voor het opzetten van een kamer voor live cell imaging.
Abstract
Neuronale groei kegels zijn de zeer beweeglijke structuren op het puntje van axonen die leiding signalen kan detecteren in de omgeving en transduceren deze informatie in directionele beweging in de richting van de juiste doelcel. Om volledig te begrijpen hoe begeleiding informatie wordt doorgestuurd vanaf de cel oppervlak naar de onderliggende dynamische cytoskelet-netwerken, moet men een model dat geschikt is voor live-cell imaging van eiwitten dynamiek bij hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Typische gewervelde groei kegels zijn te klein om kwantitatief te analyseren F-actine en microtubuli dynamiek. Neuronen van de zee haas Aplysia californica zijn 5-10 keer groter dan gewervelde neuronen, kan gemakkelijk worden bewaard bij kamertemperatuur en zijn zeer robuust cellen voor micromanipulatie en biofysische metingen. Hun groei kegels zijn zeer gedefinieerd cytoplasmatische regio's en een goed beschreven cytoskelet systeem. De neuronale cellichamen kan worden gemicroinjecteerd met een verscheidenheid van sondes voor het bestuderen van de groei kegel beweeglijkheid en begeleiding. In het huidige protocol waarin we aantonen dat er een procedure voor dissectie van de abdominale ganglion, de cultuur van de tas cel neuronen en het opzetten van een imaging kamer voor live-cell imaging van de groei kegels.
Protocol
Discussion
Aplysia zak cel neuronen zorgen voor een serumvrij neuronale celkweek systeem met zeer weinig niet-neuronale cellen. Deze neuronen vormen zeer grote toename kegels geschikt is om een aantal belangrijke celbiologische vragen te beantwoorden. Tas cel neuronen kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd en afgebeeld op kamertemperatuur gedurende enkele uren. Het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) kan men kwantitatief de verschillende parameters van F-actine en microtubuli polymerisatie en translocatie dynamiek te analyseren. Deze imagin…
Acknowledgements
We willen graag Ryan Maneri (Scholekster Productions, LLC) bedanken voor het filmen onze procedure en Rodney McPhail (Department of Biological Sciences, Purdue University) voor hulp bij het bewerken van de dissectie video. Onderzoek in het lab Suter wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01 NS049233) en de Bindley bio-Center aan de Purdue University naar DMS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| #1 glass coverslips 22×22 mm | Tool | VWR | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22×22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts Inc | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington | LS02111 |
Referenzen
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
