Neurônios Aplysia californica desenvolver cones grande crescimento na cultura que são excelentes para imagens de alta resolução da motilidade cone de crescimento e orientação. Aqui, apresentamos um protocolo para a dissecção e chapeamento de neurônios células Aplysia saco, bem como para a criação de uma câmara para imagens de células vivas.
Abstract
Cones de crescimento neuronal são as estruturas altamente móveis na ponta dos axônios que podem detectar sinais de orientação no meio ambiente e transdução esta informação em movimento direcional para a célula de destino. Para entender completamente como a informação é transmitida a orientação da superfície da célula para a dinâmica subjacente redes do citoesqueleto, um precisa de um sistema modelo adequado para imagens de células vivas da dinâmica de proteínas na resolução temporal e espacial de alta. Típicos cones de crescimento vertebrados são pequenos demais para analisar quantitativamente F-actina e dinâmica de microtúbulos. Neurônios da lebre do mar Aplysia californica são 5-10 vezes maior do que os neurônios dos vertebrados, podem ser facilmente mantidos em temperatura ambiente e são células muito robusta para micromanipulação e medidas biofísicas. Cones seu crescimento tem muito definido regiões do citoplasma e um sistema bem-descrito do citoesqueleto. Os corpos celulares neuronais podem ser microinjeção com uma variedade de sondas para estudar a motilidade cone de crescimento e orientação. No presente protocolo que demonstrar um procedimento para a dissecção do gânglio abdominal, a cultura de neurônios de células saco e criação de uma câmara de imagem para imagens de células vivas de cones de crescimento.
Protocol
Soluções L15-ASW meio de cultura celular (1l) 1 saco de pó L15 adicionar 800 ml de H 2 O ultrapura NaCl 400 mM MgSO 4 27 mM MgCl 2 28 mM L-Glutamina 4mM Gentamicina 50 mg / ml HEPES 5 mM Ajustar o pH 7,9 Adicione gota a gota, CaCl 2 9,3 mM (parar se precipita) Adicionar H 2 O ultrapura a 1 l Verifique osmolaridade (950-1000 mmol / kg) …
Discussion
Neurônios de células Aplysia fornecer um saco de soro livre de sistema de cultura de células neuronais, com muito poucas células não-neuronais. Estes neurônios formam cones de crescimento muito grande, adequado para tratar uma série de questões importantes células biológicas. Neurônios de células saco pode ser facilmente manipulado e fotografada em temperatura ambiente durante várias horas. Usando Microscopia fluorescente Speckle (FSM) pode-se analisar quantitativamente os vários parâmetros de F-actina e polimerização dos m…
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Ryan Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) para filmar o nosso procedimento e Rodney McPhail (Departamento de Ciências Biológicas, Purdue University) para a assistência com a edição do vídeo de dissecação. Pesquisa no laboratório Suter é suportado por concessões do NIH (NS049233 R01) e do Centro de Biociências Bindley da Universidade Purdue, a DMS
Lee, A. C., Decourt, B., Suter, D. M. Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones. J. Vis. Exp. (12), e662, doi:10.3791/662 (2008).