الكمي لسرطان الثدي الغزو خلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج
Summary
توفر هذه المقالة منهجيات تفصيلية لاستخدام ثلاثية الأبعاد (3D) فحوصات لتحديد سرطان الثدي غزو الخلية. على وجه التحديد، ونحن مناقشة الإجراءات المطلوبة لانشاء مثل هذه المقايسات، الكمي، وتحليل البيانات، فضلا عن أساليب لدراسة فقدان النزاهة الغشاء الذي يحدث عندما تغزو الخلايا.
Abstract
بات معروفا أن المكروية الخلوية والأنسجة والمنظمين الحرجة التي تؤثر على بدء الورم والتقدم. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت المصفوفة خارج الخلية (ECM) ليكون منظم تنتقد سلوك الخلية في الثقافة والتوازن في الجسم الحي. النهج الحالي لزراعة الخلايا على ثنائي الأبعاد (2D)، والنتائج الأسطح البلاستيكية في اضطراب وفقدان التفاعلات المعقدة بين الخلايا والمكروية بهم. من خلال استخدام ثلاثية الأبعاد (3D) المقايسات والثقافة، وضعت شروط للتفاعل الخلايا المكروية تشبه المكروية في الجسم الحي. توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لزراعة خلايا سرطان الثدي في مصفوفة 3D الطابق السفلي بروتين الغشاء، لاثبات القدرة الثقافة 3D في تقييم غزو الخلايا في البيئة المحيطة. بالإضافة إلى ذلك، نحن نناقش كيف يكون لهذه المقايسات 3D القدرة على دراسة فقدان إشارة molecules التي تنظم مورفولوجيا الظهارية بواسطة المناعية الإجراءات. مساعدة هذه الدراسات لتحديد تفاصيل الآلية الهامة في عمليات تنظيم الغزو، اللازمة لانتشار سرطان الثدي.
Introduction
الهجرة وغزو الخلايا الفردية أو الجماعية نوعان من السمات المميزة لمرض السرطان، والمطلوبة للانتشار النقيلي خلايا سرطان 1-4. قدرة الخلايا السرطان لبدء ورم خبيث يعتمد على قدرتها على الهجرة وغزو الأنسجة المجاورة في استخدام invadopodia للحط من الغشاء القاعدي الخلايا. Invadopodia ديناميكية نتوءات تدهور المصفوفة الأكتين الغنية التي تمكن تدهور المصفوفة خارج الخلية من خلال إطلاق سراح-مهينة مصفوفة البروتياز 5. غزو الخلايا السرطانية ينطوي على تدهور المصفوفة تليها الهجرة من الخلايا السرطانية، وهذا يترافق مع إعادة تنظيم ثلاثية الأبعاد (3D) بيئة مصفوفة 2. وبالتالي، لاختراق من خلال مصفوفة، خلية يجب تحويل شكله والتفاعل مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) 2.
الحفاظ على سلامة أنسجة الثدي يعتمد على المراقب المالي بإحكامالعمارة الأنسجة د منذ تقاطعات خلية ECM وخلية خلية التصاق تؤثر التعبير الجيني وتعطيل قطبية الظهارية يمكن أن تؤدي إلى ظهور السرطان 6-10. ومع ذلك، فإن معظم في المختبر الهجرة والغزو المقايسات مثل transwell المقايسات غرفة أو المقايسات الجرح للخدش هي ثنائية الأبعاد (2D)، وبالتالي إهمال هذه التفاعلات المعقدة بين الخلايا والبيئة المجاورة لها 3،6،8،11-14. تم الكشف عن الاختلافات المورفولوجية والوظيفية كبيرة بما في ذلك الاختلافات في التشكل الخلوي، والتمايز الخلوي، التصاقات خلية مصفوفة وأنماط التعبير الجيني عن طريق زراعة الخلايا في الثقافات 3D التي تفتقر عادة في المقايسات 2D 2،6،8،11. وبالتالي، يستخدم من المقايسات 3D هي مفيدة بشكل كبير في تلخص أكثر الفسيولوجية في الجسم الحي حالة، مما أدى إلى ترجمة أفضل النتائج آفاقا جديدة في مجال البحوث الأساسية إلى العيادة 6-10. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى، على الرغم من العديد من المزايا المكتسبة من استخدام الثقافات 3D، وهذا النموذج لا يمكن القبض على جميع من تعقيدات في الجسم الحي الورم المكروية التي تضم مختلف أنواع الخلايا. ومع ذلك، فمن الممكن لدمج الخلايا اللحمية في نماذج 3D (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، الكريات البيض، والضامة) لدراسة تأثير التفاعلات للورم اللحمية على التصاق الخلايا السرطانية والغزو 15-17.
خلايا الثدي الظهارية في الثقافة تنمو أكثر فعالية عندما البروتينات ECM مثل laminin والكولاجين موجودة. مع هذا معروف، وقد استمدت خليط مصفوفة المتاحة تجاريا من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) الورم الفئران وكما هو معروف غشاء الطابق السفلي مصفوفة Matrigel 2،8. وقد أنشئ عدد من التقنيات لزراعة الخلايا الظهارية كما المستعمرات 3D في الغشاء القاعدي مصفوفة 2،8. الطابق السفلي غشاء نموذج مصفوفة 3D فعالة لإنشاء خلايا الثدي الخبيثة على حد سواء وغير الخبيثةالنمو، تشبه ما يحدث في الجسم الحي في البيئة 18،19. الخلايا هي الخلايا الظهارية MCF10A الثديية غير الخبيثة. عندما نمت في الطابق السفلي مصفوفة الغشاء، وهذه الخلايا في المعرض الصفات المجراة من خلايا الثدي العادية والخضوع لسيطرة تكاثر الخلايا، والاستقطاب الخلية، وموت الخلايا المبرمج لإنشاء مساحة التجويف 8،12،20. وعلاوة على ذلك، وظهور نواة خلية من خلايا MCF10A تشكيل عنيبات في الثقافات 3D أكثر شبها تلك الخلايا الظهارية الثديية في الأنسجة من تلك المستزرعة في أحادي الطبقة 21. وكانت الدراسات التي بيسيل وزملاؤه أول من كشف عن أن خلايا الثدي الخبيثة يمكن أن تكون متباينة من خلايا الثدي غير الخبيثة عندما نمت في محيط-laminin الغنية، منذ عرض الخلايا الخبيثة النمط الظاهري غير منظم للغاية، وزيادة الانتشار، وانخفضت الخلية الى التصاق الخلايا، وزيادة التعبير عن علامات الوسيطة وزيادة في عدد الغازية شكلت هيكل 3،6،22.
يمكن تشوهات البيئة خلية التأثير تشكيل الورم 20. طريقة الثقافة 3D يمكن استخدامها لدراسة فعالية الاتصال الذي يحدث بين الخلايا السرطانية والبيئة المحيطة بها وتحديد كيفية تعبير البروتين مثل هذه التأثيرات 14،20،21،23 الاتصالات. توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لتنمو MDA-MB-231 خلايا سرطان الثدي في الثقافات 3D لتحليل الغازية، ودراسة فقدان مورفولوجيا الظهارية باستخدام laminin علامة الظهارية، وهو مكون من الغشاء القاعدي الخلايا 18،19،24، 25. توفير الإجراءات التفصيلية القدرة على تحديد بدقة وبتكاثر النجمية (الغازية) تشكيل هيكل من قبل أي الخلايا السرطانية الغازية وليس يحد إلى الثدي شيوعا خطوط الخلايا السرطانية (مثل MDA-MB-231، Hs578T، MCF-7، أو T47D ). وبالتالي، يمكن هذا الاختبار بمثابة منصة لتقييم كيفية التعبير البروتين في الخلايا أو العلاج مع الموالاة أو المضادة للمركبات الغازية تنظيم تدهور المصفوفة خارج الخلية، من قبل خلايا مفردة أو متعددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد سمح تطوير تقنيات زراعة الخلايا 3D الباحثين لدراسة تحويل خلايا الثدي الظهارية، مما يسمح لنا لتصور التغيرات المورفولوجية دراماتيكية. إلى جانب تحليل غزو الخلايا والأجسام الشبه الكروية الظهارية الثديية واحدة أو متعددة الخلايا يمكن استخدامها لتقييم التغيرات في الت?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
Referencias
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
