Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model
Summary
Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.
Abstract
Het is nu bekend dat de cellen en weefsels micro-omgeving zijn kritische toezichthouders beïnvloeden tumor initiatie en progressie. Bovendien heeft de extracellulaire matrix (ECM) is aangetoond dat een kritische regulator van celgedrag in cultuur en homeostase in vivo. De huidige benadering van het kweken van cellen op tweedimensionale (2D), kunststof oppervlakken leidt tot verstoring en verlies van complexe interacties tussen cellen en hun micromilieu. Door het gebruik van driedimensionale (3D) cultuur assays, worden de voorwaarden voor cel-interactie micro vastgesteld lijkt de in vivo micro-omgeving. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie om borstkanker cellen groeien in een 3D basaal membraan eiwit matrix, tekenend is voor het potentieel van de 3D-cultuur in de beoordeling van de cel invasie in de omgeving. Daarnaast bespreken we hoe deze 3D assays hebben de potentie om het verlies van signalering Molec onderzochtules dat epitheliale morfologie reguleren door immuunkleuring procedures. Deze studies helpen belangrijke mechanistische informatie te verkrijgen in de processen reguleren invasie, vereist voor de verspreiding van borstkanker.
Introduction
Migratie en invasie van individuele of collectieve cellen zijn twee kenmerken van kanker, en die nodig zijn voor de metastatische verspreiding van kankercellen 1-4. Het vermogen van kanker cellen om metastase te starten hangt af van hun vermogen om te migreren en binnen te dringen in het naburige weefsel met behulp invadopodia aan de basale membraan van de cellen af te breken. Invadopodia zijn dynamisch actine-rijke matrixafbraak uitsteeksels die afbraak van de extracellulaire matrix mogelijk door het vrijkomen van matrix-afbrekende proteasen 5. Kankercel invasie omvat de afbraak van de matrix gevolgd door de migratie van kankercellen en dit gepaard met een reorganisatie van de driedimensionale (3D) matrix milieu 2. Zo te dringen door de matrix, een cel moet zijn vorm veranderen en interactie met de extracellulaire matrix (ECM) 2.
Het onderhoud van het borstweefsel integriteit afhankelijk van strak controlled weefselarchitectuur aangezien cel-ECM en cel-cel adhesie verbindingen beïnvloeden genexpressie en verstoring van epitheliale polariteit kan leiden tot het ontstaan van kanker 6-10. Echter, de meeste in vitro migratie en invasie assays zoals transwell kamer assays of wond krassen testen zijn tweedimensionale (2D) en bijgevolg deze verwaarlozing de wisselwerkingen tussen cellen en hun onmiddellijke omgeving 3,6,8,11-14. Aanzienlijke morfologische en functionele diversiteit, waaronder variaties in cellulaire morfologie, celdifferentiatie, cel-matrix adhesie en genexpressie patronen zijn ontdekt door het kweken van cellen in 3D culturen die vaak ontbreken in 2D-assays 2,6,8,11. Aldus gebruikt 3D assays aanzienlijk gunstig indient een fysiologische in vivo toestand, waardoor een betere vertaling baanbrekende bevindingen basisonderzoek naar de kliniek 6-10. Er moet echter worden opgemerktOndanks de vele voordelen die het gebruik van 3D culturen, dit model niet alle van de complexiteit van de in vivo tumormicromilieu dat verschillende celtypen omvat vangen. Het is echter mogelijk om stromale cellen nemen in de 3D-modellen (bijv. fibroblasten, leukocyten en macrofagen) het effect van tumor-stromale interacties over kanker celadhesie en invasie 15-17 bestuderen.
Borst epitheliale cellen in kweek groeien het meest effectief wanneer ECM eiwitten zoals laminine en collageen aanwezig zijn. Met deze bekende, is een commercieel verkrijgbaar mengsel matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muriene en staat bekend als Matrigel basaalmembraan matrix 2,8. Een aantal technieken zijn ingesteld om epitheelcellen 3D kolonies groeien basaalmembraan matrix 2,8. De 3D basale membraan matrix model effectief is voor het vaststellen van zowel maligne en niet-maligne borstcelgroei, lijkt op wat er gebeurt de de in vivo omgeving 18,19. MCF10A cellen niet-maligne mamma epitheelcellen. Wanneer gekweekt in basaalmembraan matrix deze cellen vertonen in vivo eigenschappen van normale borstcellen ondergaan gecontroleerde celproliferatie, polarisatie en apoptose het lumen ruimte 8,12,20 stellen. Ook het uiterlijk van celkernen van MCF10A cellen die acini in 3D culturen dichter op die van mammaire epitheelcellen in weefsel dan gekweekt in monolaag 21. Studies van Bissell en collega's waren de eerste om te tonen dat kwaadaardige borst cellen kunnen worden onderscheiden van niet-kwaadaardige borstcellen wanneer gekweekt in een laminine-rijke omgeving, aangezien de kwaadaardige cellen vertonen een zeer ongeorganiseerd fenotype, verhoogde proliferatie, verminderde cel- celadhesie, verhoogde expressie van mesenchymale markers en een toename van het aantal invasieve structuur gevormd 3,6,22.
Afwijkingen van de cel milieu tumorvorming 20 beïnvloeden. De 3D kweekmethode kan worden gebruikt om effectief bestuderen communicatie die plaatsvindt tussen de tumorcellen en hun omgeving en bepalen hoe eiwitexpressie invloeden communicatie 14,20,21,23. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie voor MDA-MB-231 borstkankercellen groeien in 3D culturen invasiveness te analyseren, en om het verlies van epitheliale morfologie met een epitheliale marker laminin, een onderdeel van de cel basale membraan 18,19,24 bestuderen, 25. De voorschriften bieden de mogelijkheid om nauwkeurig en reproduceerbaar kwantificeren stervormige (invasieve) structuurvorming door een invasieve kankercel en niet beperkend voor de gemeenschappelijke borstkankercellijnen (zoals MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 of T47D ). Zo kan deze bepaling als platform voor het evalueren hoe eiwitexpressie in cellen of behandeling met pro-of anti-invasieve verbindingen regelen extracellulaire matrix degradatie, door een of meerdere cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van 3D celkweektechnieken heeft onderzoekers toegestaan om de transformatie van borst epitheelcellen bestuderen, zodat we de dramatische morfologische veranderingen zichtbaar. Naast het analyseren celinvasie, kan het een of multicellulaire sferoïden mammaire epitheliale worden om veranderingen in cellulaire adhesie, proliferatie, maat en basale-apicale polariteit beoordelen. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden waarbij de cellen bedekt met ECM 8, onze methode sluit de cellen …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
Referencias
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
