Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu
Summary
Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.
Abstract
Şimdi de hücre ve doku mikro çevre tümör başlangıcı ve ilerlemesini etkileyen kritik düzenleyiciler olduğu bilinmektedir. Ayrıca, hücre dışı matris (ECM) in vivo kültür ve homeostazında hücre davranışını önemli bir düzenleyici olduğu gösterilmiştir. Iki boyutlu (2D) üzerindeki hücrelerin kültüre mevcut yaklaşım, hücreler ve bunların mikro arasındaki karmaşık etkileşimlerin rahatsızlık ve zarar plastik yüzeyler sonuçları. Üç boyutlu (3D) kültür tahlillerin kullanımı sayesinde, hücreye mikro-ortam etkileşimi için koşullar, in vivo benzer mikro kurulmuştur. Bu makalede, etrafındaki çevreye hücre istilası değerlendirilmesinde 3D kültür potansiyelini örnekleme, 3 boyutlu bir bazal membran protein matrisi içinde meme kanseri hücrelerinin büyümesini detaylı bir yöntem sağlar. Buna ek olarak, bu deneyler, 3D molekül ağırlığına işaret kaybını incelemek için potansiyele sahip görüşmekprosedürleri immün epitel morfolojisi Modüller düzenler. Bu çalışmalar meme kanseri yayılması için gerekli istilasını düzenleyen işlemler, içine önemli mekanik bilgilerini tespit etmek yardım.
Introduction
Göç ve bireysel ya da kolektif hücrelerin işgali kanseri iki özellikleridir ve kanser hücrelerinin 1-4 metastatik yayılması için gereklidir. Metastaz başlatmak için kanser hücrelerinin yeteneği göç ve hücrelerin, temel zara inerek için invadopodia kullanarak komşu doku içine işgal etme yeteneğine bağlıdır. Invadopodia matris-bozucu proteazlar 5 salınmasıyla hücre dışı matrisin bozulmasını sağlayacak dinamik aktin zengin matris bozulması çıkıntılar bulunmaktadır. Kanser hücre istilası kanser hücrelerinin taşınması takip matrisin bozulmasını içerir ve bu, üç boyutlu (3D) matris ortamı 2 bir yeniden eşlik eder. Bu durumda, matris boyunca nüfuz bir hücre şekli dönüştürmek ve hücre dışı matrisin (ECM) 2 ile etkileşim gerekir.
Meme dokusu bütünlüğünün bakım sıkı controlle bağlıdırhücre-ECM ve hücre-hücre yapışma bağlantıları gen ekspresyonu ve epitel kutupluluğun bozulması etkilediğinden d, doku mimarisi, kanser 6-10 başlamasından yol açabilir. Ancak, bu tür transwell oda tahlillerde ya da yara tırmığı tahlilleri gibi çok in vitro göçü ve istila deneyleri, iki boyutlu (2B) ve bu nedenle, bu hücreleri ve bunların bitişik çevre 3,6,8,11-14 arasındaki karmaşık etkileşimler ihmal. Hücresel morfoloji varyasyonlar, hücre farklılaşması, hücre-matris adezyonlar ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere önemli morfolojik ve fonksiyonel farklılıklar genel olarak 2,6,8,11 deneyleri, 2 boyutlu olarak eksik 3B kültürlerinde hücrelerin kültürlenmesi ile tespit edilmiştir. Böylece, kliniğe 6-10 temel araştırma çığır açan bulgularının daha iyi çeviri açan, 3D tahlillerin in vivo durumda bir daha fizyolojik yansıtan anlamlı yararlı edilir kullanır. Bununla birlikte, dikkat edilmelidir3D kültürlerin kullanımı ile kazanılan pek çok avantajı olmasına rağmen, bu model çeşitli hücre tiplerini içeren in vivo tümör mikro tüm karmaşıklığı yakalamak değildir. Ancak, bu 3 boyutlu modellere stromal hücreleri dahil etmek mümkündür (örneğin, fibroblastlar, lökositler ve makrofajlar) kanser hücre yapışması ve yayılması 15-17 tümör stromal etkileşimlerin etkilerini incelemek için.
Örneğin laminin ve kolajen gibi ECM proteinlerinin mevcut olduğu zaman kültür meme epitel hücrelerinin en etkili şekilde büyür. Bu bilinen ile, ticari olarak temin edilebilir matris karışımı Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murin tümör elde edilmiştir ve Matrigel taban membran matrisi 2,8 olarak bilinir. Bir takım teknikler taban membran matrisi 2,8 3D koloniler olarak epitel hücreleri büyütmek için kurulmuştur. 3D bazal membran matrisi modeli habis ve habis olmayan meme hem hücre kurulması için etkilidirbüyümesi, in vivo ortamda 18,19 meydana ne benzer. MCF10A hücreleri habis olmayan meme epitel hücreleridir. Temel zar matris içinde yetiştirildiğinde, bu hücrelerin normal meme hücrelerinin in vivo özellikleri sergiler ve hücre proliferasyonu, hücre polarizasyon ve lümen alanı 8,12,20 kurmak için kontrol apoptoza uğrarlar. Ayrıca, 3D kültürlerde asinüsü oluşturan MCF10A hücrelerinin hücre çekirdeklerinin görünümünü daha yakından dokuda, meme epitelyal hücrelerinin kişilerce tek tabaka 21 içinde kültüre daha benzemektedir. Bissell'e ve arkadaşları tarafından yürütülen çalışmalar, habis hücreler, bir çok düzensiz fenotipi gösterdiğinden, bir laminin zengin bir ortamda yetiştirilen proliferasyon artan azaldığı habis meme hücreleri habis olmayan meme hücrelerinden ayırt edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır için ilk hücreden hücre yapışması, artan mezenkimal markerlerin ekspresyonu ve invazif yapının sayısında bir artış meydana 3,6,22.
Hücre ortamı anormallikleri tümör oluşumunu 20 etkileyebilir. 3D kültür yöntemi etkili tümör hücreleri ve bunların çevreleyen çevre arasında meydana iletişimi çalışma ve ne kadar protein sentezleme etkenler, iletişim 14,20,21,23 belirlemek için kullanılabilir. Bu makalede, analiz invaziv 3D kültürlerde MDA-MB-231 göğüs kanseri hücrelerinin büyümesini ve bir epitel işaretleyici laminin, hücre bazal membran 18,19,24 bir bileşenini kullanarak epitel morfolojisi kaybını incelemek için detaylı bir yöntem sağlar 25. Detaylı prosedürler, doğru ve tekrarlanabilir bir invazif kanser hücresi tarafından yıldız şeklinde (istilacı) yapısının oluşumunu ölçmek için ve bu MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 ya da T47D gibi ortak meme kanseri hücre hatları (sınırlayıcı değildir olanağı sağlar .) Bu nedenle, bu deney ile nasıl protein hücrelerde ekspresyonu ya da tedavi değerlendirmek için bir platform olarak hizmet edebilir pro-ya da anti-invazif bileşikler, bir ya da birden çok hücre tarafından, hücre dışı matris bozulması düzenler.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D hücre kültürü teknikleri geliştirilmesi araştırmacılar bize dramatik morfolojik değişikliklere görselleştirmek için izin göğüs epitel hücrelerinin dönüşümünü incelemek için izin verdi. Hücre istilasını analiz Bunun yanı sıra, tek ya da çok-hücreli küreler, meme epitelyal hücre yapışması, proliferasyon, boyut ve bazal-apikal polariteli değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Hücreler ECM 8 ile kaplanmış olan daha önce bildirilen yöntemlere de, bizim s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
Referencias
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
