3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화
Summary
이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
그것은 지금 잘 세포 및 조직 미세 종양의 개시 및 진행에 영향을 미치는 중요한 규제 것으로 알려져있다. 또한, 세포 외 기질 (ECM)는 생체 내에서의 문화와 항상성에있는 세포 행동의 중요한 조절기로 입증되었습니다. 이차원 (2D)에서 세포를 배양의 현재의 접근 방식, 그리고 그들의 세포 미세 환경 간의 복잡한 상호 작용의 교란 및 손실 플라스틱 표면 결과. 3 차원 (3D) 배양 분석의 사용을 통해, 세포 미세 환경 상호 작용을위한 조건은 생체 내 미세 환경을 닮은 확립된다. 이 문서는 주변 환경에 세포 침략의 평가에 3D 문화의 가능성을 예시, 3D 지하 막 단백질 매트릭스에서 유방암 세포를 성장하기위한 세부 방법론을 제공합니다. 또, 이러한 3D 분석법은 molec 신호의 손실을 검사 할 가능성이있는 방법을 논의절차를 면역 염색에서 상피 형태를 조절 ules. 이러한 연구는 유방암의 확산에 필요한 침입을 조절 공정에 중요한 기계적 세부 사항을 확인하는 데 도움.
Introduction
마이그레이션 및 개인 또는 집단 세포의 침윤 암의 두 가지 특징입니다, 암세포 1-4의 전이성 확산에 필요합니다. 전이를 개시하는 암 세포의 능력은 이주 및 세포의 기저막을 저하 invadopodia를 사용하여 인접 조직으로 침입하는 그들의 능력에 달려있다. Invadopodia 행렬 분해하는 프로 테아 제 5의 출시를 통해 세포 외 기질의 분해를 가능하게 동적 말라 풍부한 매트릭스 분해 돌출부이다. 암 세포 침윤은 암 세포의 이주 다음 행렬의 저하를 수반하고이를 3 차원 (3D) 행렬이 환경의 재구성을 수반한다. 따라서, 매트릭스를 통해 침투, 세포는 그 모양을 변형하고, 세포 외 기질 (ECM) 2와 상호 작용해야합니다.
유방 조직의 무결성을 유지 단단히 관제사,에 따라 달라집니다세포-ECM과 세포 – 세포 접착 접합 유전자 발현 및 상피 극성의 중단에 영향을 미치는 때문에 D 조직 구조는 암 6-10의 발병으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 트랜스 웰 챔버 분석이나 상처 스크래치 분석 등 대부분의 생체 외 마이그레이션 및 침입 분석은 2 차원 (2D)이며, 따라서 이러한 세포와 그 인접 환경 3,6,8,11-14 사이의 복잡한 상호 작용을 무시. 세포 형태의 변화, 세포 분화, 세포 매트릭스 유착과 유전자 발현 패턴을 포함하여 상당한 형태 학적 및 기능적 다양성은 일반적으로 2,6,8,11을 분석 차원에서 부족한 3D 배양 세포를 배양하여 검출되었다. 따라서, 진료소 6-10에 기초 연구에서 획기적인 연구 결과의 더 나은 번역을 선도, 3D 분석의 생체 내 조건에서 더 많은 생리를 recapitulating에 크게 도움이됩니다 사용합니다. 그러나, 주목해야, 3 차원 배양을 이용하여 얻은 많은 장점에도 불구하고,이 모델은 다양한 세포 유형을 포함 생체 내 종양 미세 환경의 복잡성 모두를 캡처 할 수있다. 그러나, 3D 모델로 간질 세포를 포함 할 수있다 (예를 들어, 섬유 아세포, 백혈구 및 대 식세포) 암 세포 부착 및 침윤 15-17에서 종양 – 기질 상호 작용의 효과를 연구한다.
이러한 라미닌 및 콜라겐 ECM 단백질이있을 때 문화의 유방 상피 세포가 가장 효율적으로 성장한다. 이 알려진으로, 상업적으로 이용 가능한 매트릭스 혼합물 Engelbreth-홀름 – 스웜 (EHS) 쥐의 종양에서 파생되어 리겔 기저막 매트릭스 2,8로 알려져있다. 기술의 수는 기저막 매트릭스 2,8 차원의 식민지로 상피 세포 성장하기 위해 설립되었다. 3D 기저막 행렬 모델은 악성 및 비 악성 둘 유방암 세포를 확립하기위한 효과적인성장, 생체 내 환경 (18, 19)에서 발생되는 것을 닮은. MCF10A 세포는 비 악성 유방 상피 세포이다. 기저막 매트릭스에서 성장하는 경우, 이들 세포는 정상적인 유방 세포의 생체 내 특성의 전시 및 세포 증식, 세포 편광 및 루멘 공간 8,12,20을 확립 아폽토시스를 조절 겪는다. 또한, 3 차원 배양을 형성 MCF10A 꽈리 세포의 세포 핵의 외관은 더 가깝게 조직 유선 상피 세포들 (21)에서 단층 배양에 비해 유사. 비셀 및 동료에 의해 연구는 악성 세포가 매우 무질서 표현형을 표시하기 때문에, 라미닌이 풍부한 환경에서 성장 확산을 증가, 감소하면 악성 유방 세포가 아닌 악성 유방 세포에서 분화 될 수 있다는 것을 나타 내기 위해 최초로 세포 – 투 – 세포 부착, 증가 간충직 마커의 발현 및 침입 구조 수의 증가는 3,6,2 형성된2.
셀 환경의 이상이 종양 형성 (20)에 영향을 미칠 수있다. 3D 배양법 효과적으로 종양 세포와 그 주변 환경 사이에서 발생하는 통신을 연구하는 방법과이 단백질의 발현에 영향 같은 통신 14,20,21,23를 결정하는데 사용될 수있다. 이 문서에서는, 침입을 분석하는 3 차원의 문화에서 MDA-MB-231 유방암 세포 성장을, 그리고 상피 마커 라미닌, 세포 기저막 18,19,24의 구성 요소를 사용하여 상피 형태의 손실을 연구하는 자세한 방법을 제공합니다 25. 자세한 절차는 정확하고 재현성있는 침습성 암 세포에 의해 방사상 (침습) 구조의 형성을 정량화하고 MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 또는 T47D 같은 일반적인 유방암 세포주 (에 제한되지 않는 기능을 제공한다 ). 따라서,이 분석은 방법으로 단백질의 세포에서 발현 또는 치료를 평가하기위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다 프로 또는 안티 -침략 화합물은 하나 또는 여러 개의 세포, 세포 외 기질의 분해를 조절한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D 세포 배양 기술의 개발은 연구자주세요 극적인 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있도록, 유방 상피 세포의 변화를 연구 할 수있다. 세포 침윤을 분석 외에, 단일 또는 다세포 유방 상피 세포 접착 상체는, 증식, 크기 및 기저 혀끝 극성의 변화를 평가하기 위해 사용될 수있다. 세포가 ECM (8)과 겹쳐있다 이전에보고 된 방법과는 대조적으로, 우리의 방법은 정량 할 다 방향 침입을 허용 ECM <su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
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