כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)
Summary
מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.
Abstract
עכשיו זה ידוע היטב כי microenvironment הסלולרי ורקמות הם רגולטורים קריטיים המשפיעים על התחלה של גידול והתקדמות. יתר על כן, המטריצה תאית (ECM) הוכח להיות רגולטור קריטי של התנהגות תא בתרבות ובהומאוסטזיס בגוף חי. הגישה הנוכחית של תאי culturing על דו ממדים (2D), תוצאות משטחי פלסטיק בהפרעה והאובדן של אינטראקציות מורכבות בין תאים וmicroenvironment שלהם. באמצעות השימוש במבחני תרבות תלת ממדי (3D), את התנאים לאינטראקציה התא microenvironment מבוססים דומה microenvironment in vivo. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדל תאי סרטן השד במטריצת חלבון קרום במרתף 3D, הממחיש את הפוטנציאל של תרבות 3D בהערכת פלישת תא לסביבה. בנוסף, אנו דנים כיצד יש מבחני 3D אלה הפוטנציאל לבדיקת ההפסד של איתות Molecules המווסתים את מורפולוגיה אפיתל ידי immunostaining הליכים. מחקרים אלה יסייעו לזהות פרטים מכניסטית חשובים לתהליכי ויסות פלישה, הנדרשים להתפשטות סרטן השד.
Introduction
הגירה ופלישה של תאים בודדים או קולקטיביים הן שני סימני ההיכר של סרטן, ונדרשת להתפשטות הגרורה של תאי סרטן 1-4. היכולת של תאי סרטן ליזום גרורות תלויה ביכולתם להגר ולפלוש לרקמות השכנות באמצעות invadopodia כדי לבזות את הקרום במרתף של התאים. Invadopodia הם בליטות אקטין עשיר דינמיות השפלה מטריקס המאפשרות פירוק של המטריצה תאית באמצעות השחרור של פרוטאזות משפילות מטריצת 5. פלישת תאי הסרטן כרוכה בהשפלה של המטריצה ואחרי הנדידה של התאים הסרטניים וזה מלווה בארגון מחדש של סביבת המטריצה תלת ממדי (3D) 2. לכן, כדי לחדור דרך המטריצה, תא חייב לשנות את צורתו ואינטראקציה עם מטריקס תאי (ECM) 2.
השמירה על שלמות רקמת שד תלויה בחוזקה controlleארכיטקטורת רקמת ד מאז צמתים הידבקות התא-ECM ותאי תאים משפיעים על ביטוי גנים ושיבוש של קוטביות אפיתל יכולה להוביל להופעת הסרטן 6-10. עם זאת, רוב המבחנה הגירה ופלישת מבחני בכגון transwell מבחני לשכה או מבחני פצע שריטה הם דו ממדי (2D) ולכן אלה להזניח את האינטראקציות המורכבות בין תאים וסביבתם הסמוכות 3,6,8,11-14. הבדלים מורפולוגיים ותפקודיים ניכרים, כולל שינויים במורפולוגיה תאית, התמיינות תאים, הידבקויות של תאי המטריצה ודפוסי ביטוי גנים כבר זוהו על ידי תאי culturing בתרבויות 3D שחסרי בדרך כלל במבחני 2D 2,6,8,11. לכן, משתמש במבחני 3D הם מועילים באופן משמעותי במשחזר יותר פיסיולוגי במצב vivo, שמוביל לתרגום טוב יותר של ממצאי פורצי דרך במחקר בסיסי למרפאת 6-10. עם זאת, יש לצייןלמרות היתרונות רבים שנצברו בשימוש בתרבויות 3D, מודל זה לא יכול לתפוס את כל המורכבות של in vivo microenvironment הגידול הכולל סוגים שונים של תאים. עם זאת, ניתן לשלב את תאי סטרומה לתוך המודלים 3D (לדוגמא, fibroblasts, כדוריות דם לבנות, ומקרופאגים) כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות גידולים סטרומה בהידבקות תאים סרטניים ופלישה 15-17.
תאי אפיתל שד בתרבות לגדול בצורה היעילה ביותר כאשר חלבוני ECM כגון laminin וקולגן הם הווה. עם זה ידוע, תערובת מטריצה זמינה מסחרי כבר נגזרה Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) גידול עכברי והוא ידוע בתור מטריצת קרום במרתף Matrigel 2,8. מספר טכניקות הוקמו כדי לגדל תאי האפיתל כמושבות 3D במטריצת קרום במרתף 2,8. מודל מטריצת 3D מרתף הקרום הוא יעיל להקמת תא שד הן ממאיר ושאינו ממאירצמיחה, שמזכיר את מה שמתרחש בסביבה vivo 18,19. תאי MCF10A הם תאי אפיתל החלב שאינו ממאירים. כאשר גדלו במטריצת קרום במרתף, תערוכת תאים אלה בתכונות vivo של תאי שד נורמלים ועוברים בשליטת התפשטות תאים, קיטוב תא, ואפופטוזיס להקים מרחב הלום 8,12,20. יתר על כן, הופעתו של גרעין תא של תאי MCF10A להרכיב acini בתרבויות 3D דומה יותר לאלו של תאי אפיתל החלב ברקמה מאלה בתרבית monolayer 21. מחקרים על ידי יסל ועמיתיו היו הראשונים לחשוף שיכולים להיות מובחנים תאי שד ממאירים מתאי שד אינו ממאירים כאשר גדלו בסביבת laminin עשיר, שכן התאים הממאירים להציג פנוטיפ לא מאורגן מאוד, גדל בהתפשטות, ירידה בתא אל הידבקות תא, ביטוי מוגבר של סמני mesenchymal וגידול במספר של מבנה פולשנית נוצרו 3,6,22.
חריגות של סביבת התא יכולות להשפיע על היווצרות גידול 20. שיטת תרבות 3D יכול לשמש כדי לחקור ביעילות את התקשורת המתרחשת בין התאים הסרטניים וסביבתם ולקבוע כיצד 14,20,21,23 תקשורת כגון השפעות ביטוי חלבון. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדול מד"א-MB-231 תאי סרטן השד בתרביות 3D לנתח הפולשנות, וללמוד את האובדן של מורפולוגיה האפיתל באמצעות laminin סמן אפיתל, מרכיב של הקרום במרתף תא 18,19,24, 25. הנהלים מפורטים לספק את היכולת במדויק וreproducibly לכמת stellate היווצרות מבנה (פולשנית) על ידי כל תא סרטן פולשני ולא מגבילה לשורות תאי סרטן שד השכיח (כגון מד"א-MB-231, Hs578T, MCF-7, או T47D ). לפיכך, assay זה יכול לשמש כפלטפורמה להערכה איך ביטוי חלבון בתאים או בטיפול בפרו או אנטיתרכובות פולשנית להסדיר השפלה מטריצה תאית, על ידי תאים בודדים או מרובים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפיתוח של טכניקות תרבית תאי 3D אפשר לחוקרים ללמוד את השינוי של תאי אפיתל שד, ומאפשר לנו לחזות את השינויים מורפולוגיים הדרמטיים. חוץ מניתוח פלישת תא, יכולים לשמש הספרואידים אפיתל החלב היחיד או רב תאיים כדי להעריך את השינויים בהידבקות הסלולר, התפשטות, גודל, וקוטביות הבז?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
Referencias
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
