Эта статья содержит подробные методологии использования трехмерных (3D) анализах для количественного вторжение клеток рака молочной железы. В частности, мы обсудим процедуры, необходимые для настройки таких анализах количественную и анализа данных, а также методы для изучения потерю целостности мембраны, которая возникает, когда клетки вторгнуться.
В настоящее время хорошо известно, что клеточной и тканевой микросреда являются важнейшими регуляторами, влияющие инициации и прогрессии опухоли. Кроме того, внеклеточного матрикса (ECM) было продемонстрировано, чтобы быть критическим регулятором поведения клеток в культуре и гомеостаза в естественных условиях. Нынешний подход культивирования клеток на двумерной (2D), пластиковые поверхности приводит к нарушению и потери сложных взаимодействий между клетками и их микросреды. Благодаря использованию трехмерной (3D) Культура анализов, условия для клеток микроокружения взаимодействия устанавливаются напоминающие микросреды в естественных условиях. В данной статье приводится подробная методика расти клетки рака молочной железы в матрице 3D базальной мембраны белка, иллюстрирующих потенциал 3D культуры в оценке вторжения клеток в окружающую среду. Кроме того, мы обсудим, как эти 3D анализы есть потенциал, чтобы изучить потерю Molec сигнализацииULES которые регулируют эпителиальных морфологию по иммуноокрашивания процедуры. Эти исследования помогают определить важные механистические детали в процессы, регулирующие вторжение, необходимых для распространения рака молочной железы.
Миграция и вторжение в индивидуальных или коллективных клеток два клейма рака, и требуется для метастазирования раковых клеток 1-4. Способность раковых клеток, чтобы инициировать метастазов зависит от их способности к миграции и вторжение в соседнюю ткань с использованием invadopodia деградировать базальную мембрану клеток. Invadopodia динамические актина богатых деградации матрица выступы, которые позволяют деградацию внеклеточного матрикса через выпуск матричных разрушающих протеаз 5. Вторжение Раковая клетка включает деградацию матрицы с последующим миграции раковых клеток, и это сопровождается реорганизацией трехмерное (3D) матрицы среды 2. Таким образом, чтобы проникнуть через матрицу, клетка должна преобразовывать свою форму и взаимодействуют с внеклеточным матриксом (ECM) 2.
Поддержание целостности ткани молочной железы зависит от плотно Controlleд архитектура ткани с клеточной ECM и межклеточной адгезии переходы влиять на экспрессию генов и разрушение эпителиальной полярности может привести к возникновению рака 6-10. Тем не менее, большинство в пробирке миграции и вторжения анализы, такие как Transwell камерных анализов или рана царапин анализов являются двумерные (2D) и, следовательно, они пренебрегают сложные взаимодействия между клетками и их прилегающей среды 3,6,8,11-14. Значительные морфологические и функциональные различны в том числе изменений в клеточной морфологии, клеточной дифференцировки, клетка-матрикс спаек и паттернов экспрессии генов были обнаружены путем культивирования клеток в 3D культур, которые обычно отсутствуют в 2D анализах 2,6,8,11. Таким образом, использует 3D-анализов значительно полезным в обобщал более физиологичным в естественных состоянии, что приводит к лучшему переводе новаторских находок в фундаментальных исследованиях в клинику 6-10. Тем не менее, следует отметить,, Несмотря на многие преимущества, полученных с использованием 3D-культур, эта модель не может учесть все сложности в естественных условиях опухоли микроокружения, что включает в себя различные типы клеток. Тем не менее, можно включить стромальных клеток в 3D-модели (например, фибробласты, лейкоциты и макрофаги) для изучения влияния опухолевых-стромальных взаимодействий на адгезии раковых клеток и вторжения 15-17.
Грудные эпителиальные клетки в культуре расти наиболее эффективно, когда ECM белки, такие как ламинин и коллагена присутствуют. При этом известно, имеющийся в продаже матрица смесь была получена из Engelbreth-Холм-Рой (EHS) мышиного опухоли и известен как Матригель базальной мембраны матрицы 2,8. Ряд методов были созданы расти эпителиальные клетки как 3D колоний в базальной мембраны матрицы 2,8. В подвале матричная модель 3D мембрана является эффективным для установления и злокачественной и не злокачественной клетки грудирост, напоминающее то, что происходит в окружающей среде в естественных 18,19. MCF10A клетки доброкачественных эпителиальные клетки молочной железы. При выращивании в базальной мембраны матрицы, эти клетки демонстрируют в естественных черт нормальных клеток молочной железы и пройти под контролем пролиферации клеток, клеток поляризацию, и апоптоз о создании просвета пространство 8,12,20. Кроме того, внешний вид ядрах клеток MCF10A клеток, образующих ацинусов в 3D культур больше напоминают те из эпителиальных клеток молочной железы в ткани, чем те, культивировали в монослое 21. Исследования Бисселл и коллегами были первыми, чтобы показать, что злокачественные клетки молочной железы могут быть дифференцированы от доброкачественных клеток молочной железы при выращивании в ламинином богатых окрестностях, так как злокачественные клетки отображать высоко дезорганизованы фенотип, увеличение распространения, снижение клетки к клеточной адгезии, повышенная экспрессия мезенхимальных маркеров и увеличение числа инвазивного структуру, образованную 3,6,22.
Аномалии окружающей среды клеток может влиять на формирование опухоли 20. Способ 3D культура может быть использована для эффективной изучить взаимодействие, которое происходит между опухолевыми клетками и окружающей их среды и определить, как влияет на экспрессию белка такой 14,20,21,23 связи. В данной статье приводится подробная методика расти MDA-MB-231 клеток рака молочной железы в 3D культур для анализа инвазивность и учиться потерю эпителиального морфологии с использованием эпителиальных маркеров ламинин, компонент клеточной базальной мембраны 18,19,24, 25. Подробное описание процедур обеспечивают возможность точно и воспроизводимо количественно звездчатый (инвазивный) формирование структуры на любой инвазивной раковой клетки и не ограничивая этим клеточных линий рака молочной железы общий (например, MDA-MB-231, HS578T, MCF-7 или T47D ). Таким образом, этот анализ может служить в качестве платформы для оценки того, как экспрессии белка в клетках или лечение с про-или анти-инвазивные соединения регулируют внеклеточный деградации матрицы, по одной или нескольких клеток.
Развитие 3D методы культивирования клеток позволило исследователям изучить трансформацию молочной эпителиальных клеток, что позволяет нам визуализировать драматические морфологические изменения. Кроме анализа вторжение клеток, единичные или многоклеточные эпителиальные сфероиды …
The authors have nothing to disclose.
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |