باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي
Summary
نقدم بروتوكول بشأن كيفية الاستفادة من الإنتاجية العالية التصوير المقطعي البرد الإلكترون لتحديد دقة عالية في هياكل الموقع من الآلات الجزيئية. يسمح البروتوكول كميات كبيرة من البيانات التي سيتم تجهيزها، ويتجنب الاختناقات المشتركة، ويقلل من وقت التوقف عن العمل الموارد، مما يتيح للمستخدم التركيز على المسائل البيولوجية الهامة.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
النوع الثالث أنظمة إفراز (T3SS) هي المحددات الأساسية الفوعة لكثير من الكائنات الممرضة سلبية الغرام. وinjectisome، المعروف أيضا باسم مجمع إبرة، هو آلة T3SS المركزية اللازمة لالنبات مباشرة من البروتينات المستجيب من البكتيريا في الخلايا المضيفة حقيقية النواة 1 و 2. ويضم injectisome إبرة خارج الخلية، وهي هيئة القاعدية، ومجمع حشوية المعروفة أيضا كما المجمع فرز 3. وتوضيح دراسات سابقة هياكل 3-D من injectisomes تنقيته من السالمونيلا والشيجيلا، جنبا إلى جنب مع الهياكل الذرية للبروتينات الجسم القاعدية الكبرى 4، 5. آخر في هياكل الموقع من injectisomes من السالمونيلا والشيجلا، واليرسنية كشفت عنها البرد ET 6 7. ومع ذلك، فإن مجمع حشوية، ضروري لاختيار المستجيب والتجمع إبرة، لم تصور في تلك الهياكل.
البرد ET هو موسر تقنية مناسبة لتصوير الآلات الجزيئية في قرار نانومتر ضمن سياق الخلوي الأصلي لها (في الموقع). ومع ذلك، فإن القرار يمكن تحقيقه عن طريق البرد ET محدودة بسبب عينة سماكة. للتغلب على العائق، ونحن تصوير injectisomes سليمة في الشيجلا سلالة الفلكسنرية ضراوة التي تم تعديلها وراثيا لإنتاج minicells رقيقة بما يكفي لالبرد ET. قيود أخرى من البرد ET هو حساسية من العينة للإشعاع الناجم عن شعاع الالكترون، الذي يدمر بسرعة كبيرة المعلومات ذات الدقة العالية في العينة. ونتيجة لذلك، يتم استخدام جرعات منخفضة للغاية بالنسبة الفردية الميل الصور بحيث جرعة مناسبة يمكن توزيعها بين الميل سلسلة كاملة. هذا يقلل كثيرا من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) في إعادة الإعمار النهائي، مما يجعل من الصعب التفريق بين السمات الهيكلية للموضوع من كمية كبيرة من الضوضاء في مقطعية ويحد القرار الذي يمكن تحقيقه من خلال cryo- ET. Conventiمعالجة الصور اونال مثل فورييه والمرشحات في الفضاء الحقيقي وكذلك أخذ العينات باستمرار يمكن استخدامها لزيادة النقيض من ذلك، ولكن على حساب تصفية الكثير من المعلومات ذات الدقة العالية. في الآونة الأخيرة، جعلت مقطعية الفرعي المتوسط من الممكن زيادة كبيرة في SNR وبعد ذلك القرار النهائي في بعض الحالات إلى مستويات نانومتر الفرعية 8، 9. يتم إجراء تحليل أكثر تفصيلا من المجمعات ممكن عن طريق استخراج حسابيا الآلاف من tomograms فرعية تتضمن مجالات الاهتمام من tomograms الأصلية ومن ثم مواءمة وحساب متوسط tomograms الفرعية لتحديد الهياكل المعقدة في الموقع الطبيعي مع ارتفاع SNR ودقة أعلى. هذه الأساليب يمكن أن تكون متكاملة مع نهج الجينية لتقديم رؤى أكبر في المجالس الجزيئات والتشكل ديناميكية في سياق الخلوي الأصلي.
بشكل عام، عشرات أو حتى مئات الآلاف tomograms دون حاجة إلى أن متوسط من أجل تحديد عاليةالهياكل، قرار في الموقع. الحصول على عدد كاف من الميل سلسلة اللازمة لإنتاج هذا العدد الكبير من tomograms الفرعية سرعان ما يصبح عنق الزجاجة. وغالبا ما تؤثر على الناتج الميل السلسلة التي يسببها شعاع التحول، مرحلة رد الفعل، وكذلك التكبير، والتناوب وعيوب الانحراف، والتي يجب حلها لجعل سلسلة الميل إلى محاذاة قبل إعادة الإعمار. وعادة ما يتم محاذاة سلسلة الميل عن طريق تتبع الذهب علامات إيمانية، التي يتم اختيارها بشكل تقليدي يدويا من خلال التفتيش على سلسلة الميل، مما تسبب في اختناق بعد آخر. وقد وضعت العديد من حزم البرمجيات الآلي لاكتساب الميل سلسلة من المجاهر الإلكترونية الكمبيوتر التي تسيطر عليها 10، 11، 12، والميل سلسلة المواءمة وإعادة إعمار 13 و 14 و مقطعية الفرعي في المتوسط 15-18. كما التعامل مع هذه الحزم عمليات منفصلة في سير العمل من البرد ET، يصبح من المرغوب فيه لبناء مستوى أعلى من التجريد إلى عملية SYSTEMAتبسيط tically مخطط كامل في خط أنابيب واحد. لذلك، قمنا بتطوير مكتبة المجمع البرمجيات "tomoauto" تهدف إلى تنظيم عدد من هذه الحزم إلى وحدة شبه الآلي واحدة، مما يسمح للتشغيل مستخدم بسيطة مع الحفاظ على التكوين الكامل لكل مكون بطريقة مركزية. المكتبة هي مصدر مفتوح، موثقة جيدا، وضعت بشكل مستمر ومتاح مجانا للاستخدام، والتنمية مصممة أو مزيد من التكامل وذلك عن طريق الانترنت مصدر بعيد كود مستودع (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
وقد استخدم هذا الخط البرد ET الإنتاجية العالية لتصور injectisomes سليمة في S. minicells الفلكسنرية. تم توليد ما مجموعه 1917 tomograms باستخدام هذا الأسلوب، وكشف عن قرار عالية هيكل الموقع من الجهاز سليمة في بما في ذلك منصة الفرز حشوية يحددها مقطعية الفرعي في المتوسط 19. جنبا إلى جنب مع النمذجة الجزيئية من النوع البري ومآلات utant، ويوفر خط الانابيب الإنتاجية العالية لدينا وسيلة جديدة لفهم بنية ووظيفة injectisome سليمة في سياق الخلوي الأصلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة الإنتاجية العالية وصفها هنا مكننا من معالجة 1917 البرد الميل سلسلة وتنتج أكثر من 4500 tomograms الفرعية للS. سليمة الفلكسنرية injectisome 19. وأدت البيانات التي تم جمعها على توصيف مفصل للinjectisome في الموقع، بما في ذلك حشوية الفرز المعقدة. وقد استخدمت هذ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ويليام مارغولين للتعليق. ونحن ممتنون للدعم على SerialEM من الدكاترة. ديفيد Mastronarde وتشن شو. DM، تم دعم BH وJL بواسطة غرانت R01AI087946 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، المنح R01GM110243 وR01GM107629 من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS)، ومنحة AU-1714 من مؤسسة وولش. وقد تم تمويل كاشف الإلكترون المباشر من قبل المعاهد الوطنية للصحة جائزة S10OD016279.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Referencias
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
