Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해
Summary
우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
유형 III 분비 시스템 (T3SS)는 많은 그람 음성 병원균에 필수적인 독성 결정이다. 또한 바늘 착체라고도 injectisome은 진핵 숙주 세포를 1, 2로 박테리아에서 이펙터 단백질의 직접적인 전좌 필요한 중앙 T3SS 기계이다. injectisome가 외 바늘 기저 체 및 세포질 착체를 포함라고도 정렬 복잡한 3 등. 이전의 연구는 중요한 기초 체 단백질 (4, 5)의 원자 구조와 함께, 살모넬라 및 시겔로부터 정제 injectisomes의 3 차원 구조를 해명했다. 살모넬라, 시겔 라 (Shigella), 및 예 르시 니아에서 injectisomes의 동일계 구조 최근-ET 크라이 (6)에 의해 드러난 7. 그러나, 이펙터 선택 및 니들 어셈블리에 필수적인 세포질 단지는, 그 구조에 가시화되지 않았습니다.
곳을 알아내는 – 동부 MOS입니다(원위치) 네이티브 휴대 맥락 나노 해상도 기계 분자 이미징에 적합한 기술을 t. 그럼에도 불구하고, 극저온 동부에 의해 달성 해상도는 시편의 두께에 의해 제한된다. 단점을 극복하기 위해, 우리는 유 전적으로 크라이 동부 충분히 얇은 minicells을 생산하기 위해 수정 된 악성 시겔 flexneri 변형에 그대로 injectisomes 군데. 극저온 ET의 또 다른 한계는 매우 신속하게 샘플 고해상도 정보를 파괴 전자빔에 의한 조사에 시료의 감도이다. 적합한 투여 량은 전체 기울기 계 사이에 분산 될 수 있도록 그 결과, 매우 낮은 투여 량은 개개의 틸트 – 이미지에 사용된다. 이것은 매우 어려운 단층 소음의 다량에서 피사체의 구조적 특징을 구별 할 수있게하고 cryo-에 의해 달성 될 수있는 해상도를 제한 최종 재구성 된 신호 대 잡음비 (SNR)를 낮춘다 동부. Conventi이러한 푸리에 리얼 공간 필터로서뿐만 아니라, 다운 샘플링 ONAL 화상 처리는 콘트라스트를 높이기 위해 사용하지만, 고해상도 많은 정보를 필터링을 희생 할 수있다. 최근에는, 서브 – 단층 평균화 가능 크게 SNR을 증가시키고 서브 – 나노 미터 수준 (8, 9)에 어떤 경우에는 이후에 최종 해상도로했다. 착물의보다 상세한 분석이 가능해진다 계산적 함유 서브 단층 촬영 수천 추출하여 정렬하고 하위 단층 촬영을 평균 원래 단층 촬영 및 관심 분야는 높은 SNR 및 높은 해상도와 현장 복잡한 구조에서 결정합니다. 이러한 방법은 거대 분자 어셈블리와 네이티브 휴대 문맥에서의 동적 배좌에 더욱 통찰력을 제공하는 유전자 접근법과 통합 될 수있다.
일반적으로 수십 또는 서브 – 단층 촬영 천 수백 고 판정하기 위해 평균화 될 필요현장에서 -resolution 구조. 틸트 시리즈의 충분한 수의 인수는 서브 단층 촬영이 많은 빠르게 병목 현상이 생산하는 데 필요한. 그 결과 틸트 시리즈는 종종 재건하기 전에 정렬로 기울기 시리즈를 가지고 해결해야 빔에 의한 변화, 무대 반발뿐만 아니라, 확대, 회전 및 기울이기 결함에 의해 영향을 받는다. 틸트 시리즈는 일반적으로 또 다른 병목 현상을 일으키는 원인이 전통적으로 수동 기울기 시리즈의 검사를 통해 선택 추적 금 기준 마커,에 의해 정렬됩니다. 많은 소프트웨어 패키지 (11), (12), 틸트 계 정렬 및 재구성 (13) (14)와 서브 – 단층은 평균 15-18 컴퓨터 제어 전자 현미경 (10)을 통해 자동 기울기 계 획득을 위해 개발되어왔다. 이러한 패키지는 극저온 ET의 흐름에서 개별 작업을 처리, 그것은 SYSTEMA에 프로세스에 높은 레벨의 추상화를 구축하는 것이 바람직하게학적으로 하나의 파이프 라인으로 전체 체계를 간소화. 따라서 집중적으로 각 성분의 전체 구성을 유지하면서 간단한 사용자 조작을 허용 하나 반 자동화 기기에이 패키지의 번호를 정리하기위한 "tomoauto"소프트웨어 래퍼 라이브러리를 개발했다. 도서관은 온라인 원격 소스 코드 저장소 (http://github.com/DustinMorado/tomoauto)에 의해 오픈 소스, 잘 문서화 지속적으로 개발 및 사용을위한 자유롭게 사용할 수, 맞춤형 개발 또는 추가 통합이다.
이 높은 처리량 크라이 동부 파이프 라인 (S)에 그대로 injectisomes을 시각화하기 위해 이용되고있다 flexneri minicells. 1,917 단층 촬영의 총 서브 단층 (19)을 평균함으로써 결정 세포질 정렬 플랫폼을 포함한 컴퓨터 본래의 동일계 구조 고해상도을 드러내는,이 방법을 사용하여 생성 하였다. 함께 야생 타입 및 m-의 분자 모델링utant 기계는, 우리의 높은 처리량 파이프 라인은 네이티브 휴대 컨텍스트 손상 injectisome의 구조와 기능을 이해하기위한 새로운 수단을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기술 된 고 처리량 방법이 1,917 크라이 틸트 계를 처리하고 그대로 S. 4,500 이상의 서브 단층 촬영을 생성 할 수있었습니다 flexneri 19 injectisome. 수집 된 데이터는 복잡한 정렬 세포질을 포함하여 현장 injectisome에서의 세부 특성화되었다. 방법은 또한 injectisome의 정렬 플랫폼의 구성을 명료하게 도왔다 추정의 단백질 성분의 특정 결실, 여러 돌연변이 세포를 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 의견 박사 윌리엄 Margolin 감사합니다. 우리는 박사에서 SerialEM의 지원에 감사합니다. 데이비드 Mastronarde과 첸 쑤. DM, BH와 JL은 웰치 재단 알레르기 및 전염병 국립 연구소, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS)에서 보조금 R01GM110243과 R01GM107629, 그랜트 AU-1714에서 그랜트 R01AI087946에 의해 지원되었다. 직접 전자 검출기는 건강 상 S10OD016279의 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Referencias
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