Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia
Summary
Nós apresentamos um protocolo sobre como utilizar de alto rendimento tomografia crio-eletrônica para determinar alta resolução em estruturas in situ de máquinas moleculares. O protocolo permite que grandes quantidades de dados a serem processados, evita gargalos comuns e reduz o tempo de inatividade de recursos, permitindo que o usuário se concentrar em questões biológicas importantes.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
Tipo III sistemas de secreção (T3SS) são determinantes de virulência essenciais para muitos patógenos gram-negativas. O injectisome, também conhecido como o complexo de agulha, é a máquina central de T3SS necessária para a translocação directa de proteínas efectoras a partir da bactéria em células hospedeiras eucarióticas 1, 2. A injectisome compreende uma agulha extracelular, uma basal do corpo, e um complexo citoplasmático também conhecida como o complexo de triagem 3. Estudos anteriores elucidado estruturas 3-D de injectisomes purificadas de Salmonella e Shigella, juntamente com as estruturas atômicas de grandes proteínas do corpo basais 4, 5. Recentes em estruturas in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella, e Yersinia foram revelados por crio-ET 6 , 7. No entanto, o complexo citoplasmático, essencial para a selecção efectora e conjunto de agulha, não foi visualizado nessas estruturas.
Cryo-ET é o most técnica adequada para a imagiologia maquinaria molecular na resolução nanometros no seu contexto celular natural (in situ). No entanto, a resolução alcançável por crio-ET é limitado pela espessura da amostra. Para superar o problema, nós fotografada injectisomes intactas em um Shigella flexneri estirpe virulenta que foi geneticamente modificada para produzir minic�ulas finas o suficiente para crio-ET. Outra limitação de crio-ET representa a sensibilidade da amostra para a radiação induzida pelo feixe de electrões, que destrói muito rapidamente a informação de alta resolução na amostra. Como resultado, doses extremamente baixas são utilizados para a inclinação-imagens individuais de modo a que uma dose adequada pode ser distribuído entre a série completa de inclinação. Isto reduz grandemente a proporção de sinal-para-ruído (SNR) na reconstrução final, o que o torna difícil de diferenciar as características estruturais de objecto a partir da grande quantidade de ruído na tomografia e que limita a resolução pode ser conseguida por cryo- ET. Conventional de processamento de imagem tais como Fourier e filtros no espaço real, bem como para baixo de amostragem pode ser utilizado para aumentar o contraste, mas à custa de filtrar a maior parte da informação de alta-resolução. Recentemente, sub-Tomogram média tornou possível aumentar grandemente o SNR e, subsequentemente, a solução final em alguns casos, para níveis sub-nanômetros 8, 9. Uma análise mais detalhada de complexos é possível graças computacionalmente extrair milhares de sub-tomogramas contendo as áreas de interesse dos tomograms originais e, em seguida, alinhando e em média os sub-tomograms para determinar em estruturas complexas in situ com maior SNR e maior resolução. Estes métodos podem ser integrados com abordagens genéticas para fornecer ainda maiores insights sobre montagens macromoleculares e suas conformações dinâmicas no contexto celular nativa.
Em geral, dezenas ou mesmo centenas de milhar de sub-tomogramas precisa ser calculada a média, a fim de determinar alta-Resolução estruturas in situ. A aquisição de um número suficiente de inclinação-série necessária para produzir este grande número de sub-tomogramas rapidamente se torna um gargalo. A série de inclinação resultante são frequentemente afectados pela mudança induzida por feixe, fase folga, bem como ampliação, rotação e defeitos de inclinação, o que deve ser resolvido para trazer a inclinação-alinhamento em série antes da reconstrução. A série de inclinação é tipicamente alinhados por rastreamento marcadores fiduciais de ouro, que tradicionalmente são selecionados manualmente através de inspeção da série tilt, causando ainda um outro gargalo. Muitos pacotes de software têm sido desenvolvidos para aquisição tilt-série automatizada através controlados por computador microscópios eletrônicos de 10, 11, 12, alinhamento tilt-série e reconstrução 13, 14 e sub-tomogram média de 15-18. Como lidar com estes pacotes operações discretas no fluxo de trabalho de crio-ET, torna-se desejável para construir um nível maior de abstração no processo para systematicamente agilizar todo o esquema em um único pipeline. Por isso, desenvolvemos uma biblioteca wrapper software "tomoauto" projetado para organizar um número destes pacotes em uma única unidade semi-automatizado, permitindo a operação de usuário simples, mantendo a configuração completa de cada componente de forma centralizada. A biblioteca é open-source, bem documentado, continuamente desenvolvido e disponível gratuitamente para uso, desenvolvimento adaptado ou uma maior integração por meio de uma linha fonte remota de código repositório (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Este high-throughput crio-ET oleoduto tem sido utilizada para visualizar injectisomes intactos Em S. minic�ulas flexneri. Um total de 1,917 tomogramas foram gerados utilizando este método, revelando uma alta resolução em estrutura situ da máquina intacto, incluindo a plataforma de triagem citoplasmática determinado pelo sub-Tomogram média de 19. Juntamente com modelação molecular de tipo selvagem e mutant máquinas, a tubagem de alto rendimento fornece um novo caminho para compreender a estrutura e função da injectisome intacta no contexto celular nativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de alto rendimento descrito aqui nos permitiu processar 1.917 crio tilt-série e produzir mais de 4.500 sub-tomograms do S. intacta flexneri injectisome 19. Os dados recolhidos conduziu à caracterização detalhada de injectisome em situ, incluindo o complexo citoplasmático triagem. O método também foi utilizado para visualizar várias células mutantes com deleção específica de componentes de proteína putativos, o que ajudou a elucidar a composição da p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. William Margolin para comentários. Somos gratos pelo apoio em SerialEM dos Drs. David Mastronarde e Chen Xu. DM, BH e JL foram apoiados por Grant R01AI087946 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, concessões R01GM110243 e R01GM107629 do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS), e Grant AU-1714 da Fundação Welch. O detector eletrônica direta foi financiado pelo National Institutes of Award Saúde S10OD016279.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Referencias
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
