Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル
Summary
我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
III型分泌系（T3SS）多くのグラム陰性病原体に不可欠な病原性決定因子です。また、針複合体として知られているinjectisomeは、真核生物の宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の直接転座1、2に必要な中央T3SS機である。injectisomeが外針、基礎体温、また既知の細胞質複合体を含みますソート複雑な3など。以前の研究では、主要な基礎体タンパク質4、5の原子構造とともに、 サルモネラ菌や赤痢菌から精製injectisomesの3次元構造を解明した。 サルモネラ 、 赤痢菌 、およびエルシニアからinjectisomesのその場構造の最近の -ETクライオ6によって明らかにされました7。しかし、エフェクターの選択と針アセンブリのための本質的な細胞質複合体は、それらの構造において可視化されていません。
クライオETはモスです（ その場で ）その本来の細胞のコンテキスト内でナノメートルの分解能で分子機構を画像化するための適切な技術をtは。それにもかかわらず、クライオETによって達成可能な解像度は、試験片の厚さによって制限されます。欠点を克服するために、我々は遺伝的に凍結ETのために十分に薄いミニ細胞を産生するように改変された病原性赤痢菌株でそのままinjectisomesを画像化しました。クライオETの他の制限は、非常に迅速に、サンプル中の高解像度の情報を破棄し、電子ビームによって誘起される放射線に対する試料の感受性です。適切な用量は、完全傾斜シリーズ間で分散することができるように、その結果、非常に低い用量は、個々の傾斜画像に使用されます。これは、非常に困難なことは断層像のノイズの大量から被写体の構造的特徴を区別することを可能にすると冷凍のことで達成できる解像度を制限し、最終的な再構成における信号対雑音比（SNR）を低下させますET。 Conventiこのようなフーリエ変換し、実空間フィルタなど、ならびにダウンサンプリングonal画像処理、コントラストを高めるために使用されるが、高解像度の情報の多くをフィルタリングを犠牲にすることができます。最近、副断層像の平均を大幅にサブナノメートルレベル8,9にSNR、その後いくつかのケースでは、最終的な解像度を増加させることが可能となった。複合体のより詳細な分析は、計算含むサブ断層像の数千を抽出することによって可能となりますより高いSNRと高分解能でその場複雑な構造で決定するために、サブ断層像を位置合わせし、平均化し、元の断層像からの関心のある分野。これらの方法は、高分子集合体とネイティブ細胞環境での動的なコンフォメーションにさらに大きな洞察を提供するために、遺伝的アプローチと統合することができます。
一般的には、数十または数千のサブ断層像の何百もの高い決定するために平均化される必要がありますその場での -resolution構造。サブ断層像のこの大量生産するために必要なチルト系列の十分な数の取得が迅速にボトルネックとなります。その結果、チルトシリーズは、多くの場合、再構成の前に整列するようにチルトシリーズをもたらすために解決しなければならないビーム誘起シフト、ステージバックラッシュだけでなく、拡大、回転、スキュー欠陥の影響を受けています。チルトシリーズは、一般的に、伝統的にまだ別のボトルネックを引き起こし、チルトシリーズの検査によって手動で選択されている金基準マーカを、追跡することによって整列されます。多くのソフトウェアパッケージは、コンピュータ制御の電子顕微鏡10を介して自動化された傾斜シリーズ取得のために開発された11,12、傾斜シリーズのアライメントおよび再建13、14及びサブ断層像は、15-18を平均化されています。これらのパッケージは、クライオETのワークフローの個別の操作を処理するように、システムAのプロセスに抽象度の高いを構築することが望ましくなりますtically単一のパイプラインに全体のスキームを効率化します。したがって、我々は集中的に各コンポーネントの完全な設定を維持しながら、簡単なユーザ操作を可能にする、単一の半自動化されたユニットにこれらのパッケージの数を整理するために設計されたソフトウェアのラッパー・ライブラリー」tomoauto」を開発しました。ライブラリは、オープンソースは、よくオンラインリモートソースコードリポジトリ（http://github.com/DustinMorado/tomoauto）によって開発やさらなる統合を合わせて、継続的に開発され、使用のために自由に利用できる、文書化されています。
この高スループットクライオETパイプラインは 、Sにおける無傷injectisomesを可視化するために利用されていますフレクスナーミニセル。 1917断層像の合計は、サブ断層像19を平均することによって決定した細胞質ソーティングプラットフォームを含むインタクト機の現場構造における高分解能を明らかに、この方法を使用して生成されました。一緒に野生型およびMの分子モデリングとutantマシンは、当社の高スループットパイプラインは、ネイティブの細胞状況にそのままinjectisomeの構造と機能を理解するための新しい道を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するハイスループット法は、1917クライオチルトシリーズを処理し、そのままSの 4,500を超えるサブ断層像を生成することができましたフレクスナー injectisome 19は、収集されたデータは、複雑なソート細胞質を含め、 その場 injectisome での詳細な特性評価につながりました。この方法はまた、injectisomeの選別プラットフォームの組成を解明す?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはコメント博士ウィリアム・マーゴリンに感謝します。私たちは、博士からSerialEMのサポートに感謝しています。デビッドMastronardeとチェン徐。 DM、BHとJLは、ウェルチ財団から国立アレルギー感染症研究所、総合医科学研究所（NIGMS）から補助金R01GM110243とR01GM107629、グラントAU-1714からの助成金R01AI087946によってサポートされていました。直接電子検出器は、健康賞S10OD016279の国立研究所によって資金を供給されました。
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Referencias
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