Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography
Summary
We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
Type III secretie systeem (T3SS) zijn essentiële virulentie determinanten voor vele Gram-negatieve pathogenen. De injectisome, ook bekend als de naald complex, is de centrale T3SS machine vereist voor directe translocatie van effector eiwitten van de bacterie in eukaryote gastheercellen 1, 2. De injectisome omvat een extracellulair naald, een basale lichaamstemperatuur, en een cytoplasmatisch complex ook bekende als sorteren complex 3. Eerdere studies hebben opgehelderd 3-D structuur van gezuiverd injectisomes van Salmonella es Shigella, evenals de atomaire structuur van grote basale lichaamseiwitten 4, 5. Recente in situ structuren van injectisomes van Salmonella, Shigella es Yersinia werden onthuld door cryo-ET 6 , 7. De cytoplasmatische complex, essentieel voor effector selectie en naaldsamenstel, is niet zichtbaar in deze structuren.
Cryo-ET is het most geschikte techniek voor beeldvorming van moleculaire machines in nanometer resolutie in zijn geboorteland cellulaire context (in situ). Toch is de haalbare resolutie van cryo-ET beperkt door de dikte van het monster. Om het nadeel te overwinnen, we afgebeeld intact injectisomes in een virulente Shigella flexneri stam die genetisch gemodificeerd om minicellen dun genoeg voor cryo-ET produceren. Een andere beperking van cryo-ET is de gevoeligheid van het monster om de straling geïnduceerd door de elektronenbundel, die zeer snel vernietigt de hoge-resolutie-informatie in het monster. Hierdoor zijn zeer lage doses voor individuele tilt-beelden, zodat een geschikte dosis kan worden verdeeld over de volledige tilt-series. Dit vermindert sterk de signaal-ruisverhouding (SNR) in het uiteindelijke reconstructie, wat het moeilijk maakt de structurele kenmerken van het onderwerp van de grote hoeveelheid ruis in het tomogram differentiëren en beperkt de resolutie die kan worden bereikt door cryo- ET. Conventional beeldverwerking zoals Fourier en real-space filters en downsampling kan worden gebruikt om het contrast te verhogen, maar ten koste van het uitfilteren van veel van de hoge-resolutie gegevens. Onlangs heeft sub-tomogram middeling het mogelijk om sterk toenemen van de SNR en vervolgens de uiteindelijke resolutie in sommige gevallen sub-nanometer niveau 8, 9. Een meer gedetailleerde analyse van de complexen mogelijk door computationeel extraheren duizenden sub-tomogram bevattende de aandachtsgebieden van de oorspronkelijke tomogram en vervolgens uitlijnen en het gemiddelde van de sub-tomogram te bepalen in situ complexe structuren met een hogere SNR en een hogere resolutie. Deze werkwijzen kunnen worden geïntegreerd met genetische benaderingen nog meer inzicht verschaffen in macromoleculaire samenstellingen en hun dynamische conformaties in de natieve cellulaire context.
In het algemeen tientallen of zelfs honderden duizenden sub-tomogram moeten worden gemiddeld om vast te stellen high-Resolutie structuren in situ. De overname van een voldoende aantal van de tilt-serie die nodig zijn om de productie van dit grote aantal sub-tomogram wordt al snel een bottleneck. De resulterende tilt-serie wordt vaak beïnvloed door-beam geïnduceerde verschuiving, stadium terugslag, alsmede vergroting, rotatie en scheve gebreken, die moeten worden opgelost om de tilt-serie in lijn voorafgaand aan de reconstructie brengen. De tilt-serie wordt meestal uitgelijnd door het bijhouden van goud de vaste markers, die traditioneel met de hand door middel van controle van de tilt-serie zijn geselecteerd, waardoor nog een ander knelpunt. Veel software pakketten zijn ontwikkeld voor geautomatiseerde tilt-serie overname door de computer gestuurde elektronenmicroscopen 10, 11, 12, tilt-serie uitlijning en wederopbouw 13, 14 en sub-tomogram gemiddeld 15-18. Aangezien deze pakketten verwerken discrete activiteiten in de werkstroom van cryo-ET het gewenst wordt om een hoger abstractieniveau bouwen in het proces systematisch stroomlijnen van de gehele regeling in één pijplijn. Daarom hebben we een software wrapper library "tomoauto" bedoeld om een aantal van deze verpakkingen te ordenen in een semi-automatische eenheid, waardoor de gebruiker eenvoudige bediening met behoud van volledige configuratie van elke component op een gecentraliseerde wijze. De bibliotheek is open-source, goed gedocumenteerd, voortdurend ontwikkeld en vrij beschikbaar voor gebruik, op maat ontwikkeling of verdere integratie door middel van een online remote source code repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Deze high-throughput cryo-ET pipeline is gebruikt om intact injectisomes in S. visualiseren flexneri minicellen. Een totaal 1.917 tomogram werden gegenereerd met behulp van deze methode, onthullen een hoge resolutie in situ structuur van de intacte machine waaronder het cytoplasmatische sortering platform bepaald door sub-tomogram gemiddeld 19. Samen met moleculaire modellering van wildtype en mutant machines, onze high-throughput pijplijn biedt een nieuwe weg voor de structuur en functie van het intacte injectisome begrijpen de natieve cellulaire context.
Protocol
Representative Results
Discussion
De high-throughput hier beschreven methode ons in staat om 1917 cryo tilt-serie te verwerken en produceren meer dan 4.500 sub-tomogram van de intacte S. flexneri injectisome 19. De verzamelde gegevens tot de gedetailleerde karakterisatie van in situ injectisome, waaronder het cytoplasmatische sorteren complex. De werkwijze werd eveneens toegepast om verschillende mutantcellen visualiseren specifieke deletie van vermoedelijke eiwitcomponenten, die hielp verhelderen de samens…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. William Margolin voor commentaar. We zijn dankbaar voor de steun op SerialEM van Drs. David Mastronarde en Chen Xu. DM, BH en JL werden ondersteund door Grant R01AI087946 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, subsidies R01GM110243 en R01GM107629 van het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) en Grant AU-1714 van de Welch Foundation. De directe elektron detector werd gefinancierd door de National Institutes of Health Award S10OD016279.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Referencias
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
