Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии
Summary
Мы представляем протокол о том, как использовать высокой пропускной крио-электронной томографии для определения высокого разрешения в точке, структур молекулярных машин. Протокол позволяет большие объемы данных, подлежащих обработке, избегает общих узких мест и сокращает время простоя ресурсов, позволяя пользователю сосредоточиться на важных биологических вопросов.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
Тип III секреции системы (T3SS) являются важнейшими факторами, определяющими вирулентность для многих грамотрицательных микроорганизмов. Injectisome, также известный как иглы комплекса, является центральным T3SS машина требуется для прямого транслокации эффекторных белков из бактерий в эукариотических клетках-хозяевах 1, 2. Injectisome включает внеклеточный иглу, базальный тело, и цитоплазматический комплекс также известен как сортировочного комплекса 3. Предыдущие исследования выяснены 3-D структуры очищенных injectisomes из Salmonella и Shigella, наряду с атомными структурами крупных базальных белков в организме 4, 5. Последние в точке структур injectisomes из Salmonella, Shigella, и Yersinia выявлены крио-ЭТ 6 , 7. Тем не менее, цитоплазматический комплекс, необходимый для выбора эффекторной и узла иглы, не визуализируются в этих структурах.
Крио-ЕТ МОПт подходящую методику для визуализации молекулярные машины в нанометровым разрешением в пределах своей родной сотовой связи (на месте). Тем не менее, достижимое разрешение от крио-ЭТ ограничивается толщины образца. Чтобы преодолеть недостаток, мы отображаемого нетронутыми injectisomes в опасной Shigella Флекснера штамм, который был генетически модифицированных производить минипосылок достаточно тонкие для крио-ЭТ. Другим ограничением крио-ЭТ является чувствительность образца к радиации, вызванной электронным пучком, который разрушает очень быстро информацию с высоким разрешением в образце. В результате чрезвычайно низкие дозы используются для отдельных наклона-изображений, так что подходящая доза может быть распределена среди полного наклона серии. Это значительно снижает отношение сигнал-шум (SNR) в конечном реконструкции, которая делает его трудно отличить структурные особенности предмета, от большого количества шума в томограмме и ограничивает разрешение, которое может быть достигнуто путем крио ET. CONVENTIнальных обработки изображений, такие как Фурье и в реальном пространстве фильтров, а также вниз выборки могут быть использованы для увеличения контраста, но за счет фильтрации большей части информации с высокой разрешающей способностью. Недавно, к югу от томограмма усреднения позволили значительно увеличить SNR, а затем окончательное решение, в некоторых случаях до уровня суб-нанометровых 8, 9. Более детальный анализ комплексов стало возможным благодаря вычислительно извлечения тысячи суб-томограмм, содержащих в областях, представляющих интерес с оригинальными томограмм и затем выравнивая и среднем суб-томограммы, чтобы определить, в точке сложных структур с высокой SNR и высоким разрешением. Эти методы могут быть интегрированы с генетическими подходов, чтобы обеспечить еще большую способность проникновения в суть высокомолекулярных агрегатов и их динамических конформаций в родном сотовой связи.
В общем, десятки или даже сотни тысяч суб-томограмм должны быть в среднем для того, чтобы определить высокий-Разрешение структуры на месте. Приобретение достаточного количества наклона серии, необходимой для производства этого большое количество суб-томограмм быстро становится узким местом. В результате наклона серии часто страдают от лучевой индуцированных сдвигом, ступени зазора, а также увеличения, вращения и косых дефектов, которые должны быть решены, чтобы принести наклона рядов в соответствие до реконструкции. Серия наклона, как правило, выравнивается отслеживания золотых координатных меток, которые традиционно выбранных вручную через инспекции наклона серии, вызывающих еще один узкое место. Многие программные пакеты были разработаны для автоматизированной приобретения наклона серии через компьютерным управлением электронных микроскопов 10, 11, 12, выравнивание наклона серии и реконструкция 13, 14 и суб-томограмма усреднения 15-18. Как эти пакеты обработки дискретных операций в рабочий процесс крио-ЭТ, становится желательно построить более высокий уровень абстракции в процессе к SYSTEMAски упорядочить всю схему в одном трубопроводе. Таким образом, мы разработали программное библиотеку оболочки "tomoauto", предназначенный для организации ряда этих пакетов в одной полуавтоматической блока, что позволяет простой операции пользователя, сохраняя полную конфигурацию каждого компонента в централизованном порядке. Библиотека с открытым исходным кодом, хорошо документированы, постоянно развивается и свободно доступны для использования, с учетом развития или дальнейшая интеграция с помощью онлайн-хранилище удаленного источника кода (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Эта высокая пропускная крио-ЭТ трубопровод был использован для визуализации нетронутыми injectisomes в S. Флекснера минипосылки. В общей сложности 1,917 томограмм были получены с использованием этого метода, выявление высокого разрешения в структуре месте интактного машины включая цитоплазматической сортировки платформы определяется суб-томограмма усреднения 19. Вместе с молекулярного моделирования дикого типа и мutant машины, наша высокой пропускной трубопровод обеспечивает новые возможности для понимания структуры и функции неповрежденной injectisome в родном сотовой связи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод высокой пропускной описано здесь позволило нам обрабатывать 1,917 крио наклона рядов и производят более 4500 суб-томограммы неповрежденной S. Флекснера injectisome 19. Собранные данные привели к подробной характеристике в месте injectisome, в том числе цитоплазматических со…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Уильяма Марголина для комментариев. Мы благодарны за поддержку на SerialEM от доктора. Дэвид Mastronarde и Чэнь Сюй. ДМ, BH и JL были поддержаны грантом R01AI087946 из Национального института аллергии и инфекционных болезней, грантов и R01GM110243 R01GM107629 из Национального института общих медицинских наук (NIGMS), и Грант AU-1714 от Welch фонда. Прямой электронный детектор финансируется Национальным институтом здравоохранения премии S10OD016279.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Referencias
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
