Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için
Summary
Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
Tip III salgılama sistemleri (T3SS), birçok Gram-negatif patojenlere için gerekli hastalık oluşturma etkenleridir. Ayrıca, iğne kompleksi olarak bilinen injectisome, ökaryotik konakçı hücreler 1, 2 içine bakteri efektör protein doğrudan translokasyon için gerekli olan santral T3SS makinesidir. Injectisome hücre dışı bir iğne, bir taban gövde ve sitoplazmik bir kompleksi içerir, bilinen sıralama kompleks 3 olarak. Daha önceki çalışmalar, önemli bir bazal vücut proteinleri 4, 5 atom yapılarla birlikte, Salmonella ve Shigella saflaştırılmış injectisomes 3-D yapılar ortaya çıkarmıştır. Salmonella, Shigella ve Yersinia gelen injectisomes de situ yapıları son-ET kriyo 6 ile ortaya çıkarılmıştır , 7. Bununla birlikte, efektör seçimi ve iğne düzeneğinin için gerekli sitoplazmik kompleks, bu yapılarda görselleştirilmiştir edilmemiştir.
Cryo-ET mos olduğunu(in situ) doğal hücresel kapsamında nanometre çözünürlükte moleküler makineleri görüntüleme için uygun tekniği t. Bununla birlikte, kriyo-ET ile elde çözünürlük numune kalınlığı ile sınırlandırılmıştır. Dezavantajı aşmak için, genetik olarak cryo-ET için yeterince ince minicells üretmek için modifiye edilmiş bir öldürücü Shigella flexneri zorlanma sağlam injectisomes görüntülenmiş. Cryo-ET diğer kısıtlılığı çok hızlı bir şekilde numunede yüksek çözünürlüklü bilgi yok elektron demeti, tarafından uyarılan radyasyona örnek hassasiyetidir. Uygun bir doz, tam eğme serisi arasında dağıtılmasını ve böylece bir sonucu olarak, son derece düşük dozlar ayrı ayrı eğim görüntüler için kullanılır. Bu büyük ölçüde zor tomografisinde gürültü büyük miktarda konunun yapısal özelliklerini farklılaştırmak için hale getirir ve kriyo- elde edilebilir çözünürlüğü sınırlar son yeniden sinyal-gürültü oranı (SNR), düşürür ET. ConventiBöyle Fourier ve gerçek uzay filtreleri olarak yanı sıra örnekleme aşağı Önal görüntü işleme kontrastı artırmak için kullanılan, ancak yüksek çözünürlüklü bilgilerin çoğunu filtreleyerek pahasına yapılabilir. Son zamanlarda, bir alt tomogram ortalama mümkün ölçüde SNR artırmak ve alt nanometre seviyelerinin 8, 9, bazı durumlarda, daha sonra nihai çözünürlük yaptı. Kompleksleri daha ayrıntılı bir analizi, mümkün olmaktadır hesaplama ihtiva eden alt-tomografi binlerce ekstraksiyonuyla hizalayarak ve alt tomogram ortalama özgün tomografi ve ilgi alanları daha SNR ve daha yüksek çözünürlüğe sahip yerinde kompleks yapılara belirlemek için. Bu yöntemler makromoleküler meclisleri ve yerel hücresel bağlamda dinamik konformasyonlarına ilgili daha ayrıntılı bilgi sağlamak için genetik yaklaşımlar ile entegre edilebilir.
Genel olarak, on ya da bin alt tomografi hatta yüzlerce yüksek belirlemek için ortalama gerekenin situ -resolution yapılar. Tilt-serisi yeterli sayıda edinimi alt tomogram bu sayıda hızlı bir darboğaz haline üretmek için gerekli. Elde edilen eğim serisi genellikle yeniden önce hizaya tilt-serisi getirmek için çözülmesi gereken ışın kaynaklı kayma, sahne tepki yanı sıra büyütme, rotasyon ve çarpık kusurları, etkilenir. Tilt serisi genellikle başka darboğaz neden geleneksel el tilt-serisinin denetim yoluyla seçilen izleme altın referans belirteçler, tarafından hizalanmış. Birçok yazılım paketleri 11, 12, tilt serisi uyum ve yeniden 13, 14 ve alt tomogram 15-18 ortalama bilgisayar kontrollü elektron mikroskopları 10 aracılığıyla otomatik eğim serisi edinimi için geliştirilmiştir. Bu paketler cryo-ET iş akışında ayrı operasyonlar ele gibi, Systema'nın sürecin içine daha yüksek bir soyutlama düzeyini oluşturmak için arzu olurola- rak tek bir boru hattı içine tüm düzeni düzene. Bu nedenle, biz merkezi bir şekilde her bir bileşenin tam yapılandırmasını korurken basit kullanıcı işlemi için izin veren bir tek yarı otomatik birimine bu paketlerin bir dizi düzenlemek için tasarlanmış "tomoauto" bir yazılım sarıcı kütüphane geliştirdi. Kütüphane bir online uzaktan kaynak kod depo (http://github.com/DustinMorado/tomoauto) vasıtasıyla açık kaynak, kuyu, belgelenmiş sürekli geliştirilen ve kullanıma serbestçe kullanılabilir, özel kalkınma ya da daha fazla bütünleşmesidir.
Bu yüksek verimli cryo-ET boru S. sağlam injectisomes görselleştirmek için kullanılmıştır flexneri minicells. 1917 tomografi toplam alt tomogram 19 ortalaması alınarak saptanması sitoplazmik sıralama platformu içeren sağlam makinenin in situ yapısında yüksek çözünürlük göstererek, bu yöntem kullanılarak elde edilmiştir. Birlikte yabani tip ve m moleküler modelleme ileutant makineleri, bizim yüksek verimli boru hattı doğal hücresel bağlamda bozulmamış injectisome yapısını ve işlevini anlamak için yeni bir yol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yüksek verim yöntemi 1917 cryo tilt-serisi işlemek ve bozulmamış S. 4500 üzerinde alt tomogram üretmek için etkin flexneri 19 injectisome. Toplanan veriler kompleksi sıralama sitoplazmik dahil in situ injectisome içinde detaylı karakterizasyonu, yol açtı. Yöntem ayrıca injectisome sıralama platformun bileşimi aydınlatmak yardımcı varsayılan protein bileşenlerinin belirli bir silinmesi, birkaç mutant hücreleri görselleşti…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yorumlar için Dr. William Margolin teşekkür ederim. Biz Dr dan SerialEM üzerinde destek için müteşekkiriz. David Mastronarde ve Chen Xu. DM, BH ve JL Welch Vakfı Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü (NIGMS) den Hibeler R01GM110243 ve R01GM107629 ve Grant AU-1714 Grant R01AI087946 tarafından desteklendi. Doğrudan elektron dedektörü Sağlık Ödülü S10OD016279 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
Referencias
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T. C. Three-dimensional model of Salmonella’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331 (6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J. L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica injectisome. eLife. 2, e00792 (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369-3369 (2013).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Schur, F. K., Hagen, W. J., de Marco, A., Briggs, J. A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184 (3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157 (1), 138-147 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106 (3), 240-254 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K. H., Taylor, K. A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165 (2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C. L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M. E., McIntosh, J. R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313 (5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178 (2), 177-188 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (4), 1047-1052 (2015).
- Iancu, C. V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. , (2015).
- Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection. Science. 339 (6119), 576-579 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).
