Photobleaching maakt super resolutie beeldvorming van de FtsZ Ring in de Cyanobacterium Prochlorococcus
Summary
Hier beschrijven we een photobleaching methode ter vermindering van de autofluorescence van cyanobacteriën. Na photobleaching, wordt stochastische optische wederopbouw microscopie gebruikt voor het verkrijgen van driedimensionale Super resolutiebeelden van de cyanobacteriën FtsZ ring.
Abstract
Super resolutie microscopie is wijd verbeid gebruikt om eiwitinteractie en subcellular structuren in vele organismen te studeren. In fotosynthetische organismen, is de resolutie van de laterale van super resolutie beeldvorming echter alleen ~ 100 nm. De lage resolutie is vooral te wijten aan de achtergrond van de hoge autofluorescence van fotosynthetische cellen veroorzaakt door hoge intensiteit lasers die vereist voor super-resolutie beeldvorming, zoals stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM zijn). Hier beschrijven we een photobleaching-bijgewoonde STORM methode die ontwikkeld werd onlangs voor de mariene picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Na photobleaching, de autofluorescence van Prochlorococcus is effectief verminderd zodat die STORM kan worden uitgevoerd met een laterale resolutie van ~ 10 nm. Met behulp van deze methode, wij verwerven de in vivo driedimensionale (3-D)-organisatie van het FtsZ eiwit en karakteriseren van vier verschillende FtsZ ring morphologies tijdens de celcyclus van Prochlorococcus. De methode we hier beschrijven zouden kunnen worden vastgesteld voor de super resolutie beeldvorming van andere fotosynthetische organismen.
Introduction
Super resolutie microscopies kunnen breken de grens van de diffractie van licht en bieden een beeld binnen sub diffractie resoluties (< 200 nm). Ze hebben veel gebruikt in vele organismen eiwit lokalisatie en subcellular structuren te bestuderen. Grote super resolutie Microscopie methodes omvatten gestructureerde verlichting microscopie (SIM), gestimuleerd emissie uitputting microscopie (STED), STORM en photoactivated lokalisatie microscopie (PALM). De mechanismen en de toepassingen van deze super resolutie microscopen geweest herzien elders1,2.
STORM kan bereiken een resolutie zo hoog als 10 nm door ruimtelijke scheiding3,4. Voor de STORM, slechts één molecuul binnen een regio diffractie-limited is geactiveerd (“on”) en de rest van de moleculen geïnactiveerd (“off”) worden bewaard. Door een accumulatie van snelle switch-on en – off van afzonderlijke moleculen, kan een “diffractie-onbeperkt” beeld worden gegenereerd3. Ondertussen zijn vele soorten organische kleurstoffen en fluorescente proteïnen die van toepassing zijn in de STORM, waardoor een gemakkelijke upgrade van regelmatige fluorescentie microscopie naar hoge resolutie microscopie5,6.
STORM is niet algemeen toegepast in fotosynthetische cellen, zoals cyanobacteriën, algen, en plantaardige cellen met chloroplasten7,8, die te wijten aan het feit dat STORM is vereist hoge laser intensiteit aan station photoswitching. De hoge intensiteit laser ongunstig prikkelt sterke autofluorescence achtergrond in fotosynthetische cellen en interfereert met de lokalisatie van de single-molecuul in STORM beeldbewerking. Om te onderzoeken de subcellular structuren of eiwitinteractie in fotosynthetische cellen gebruiken als STORM, ontwikkelden we een photobleaching protocol om de achtergrond autofluorescence signalen9doven. In een immunefluorescentie kleuring routineprocedure, worden specimens blootgesteld aan wit licht van een hoge intensiteit tijdens de blokkerende stap, die de autofluorescence van fotosynthetische cellen voldoen aan de eisen voor STORM verlaagt. Dit protocol maakt het dus mogelijk om te onderzoeken gepigmenteerde organismen met STORM.
Hier beschrijven we het protocol voor het gebruik van STORM om het imago van de organisatie van FtsZ ring in de eencellige picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ is een zeer geconserveerde tubuline-achtige cytoskeletal eiwit die polymerizes om te vormen van een ring-structuur (de Z-ring) rond de omtrek van een cel10 en is van essentieel belang voor de celdeling11. Behouden van Prochlorococcus cellen zijn eerste photobleached de autofluorescent achtergrond en immunostained met een primaire anti-FtsZ antilichaam te verminderen, en vervolgens een secundair anti-konijn IgG (H + L) antilichaam is geconjugeerd met een fluorophore (b.v. , Alexa Fluor 750). Uiteindelijk, wordt STORM gebruikt voor het observeren van de gedetailleerde FtsZ ring organisaties in Prochlorococcus tijdens verschillende celcyclus stadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol, beschreven we een procedure aanzienlijk verminderen de autofluorescence van de cyanobacterium Prochlorococcus (Figuur 3 c) en, vervolgens, immunokleuring de eiwitten in de cellen, waardoor ons te gebruiken om te bestuderen van de 3D-FtsZ STORM ring morphologies in Prochlorococcus (Figuur 4). Dit protocol kan worden vastgesteld voor super-resolutie beeldvorming in andere fotosynthetische organismen.
E…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Daiying Xu voor haar technische bijstand en de reacties op het manuscript. Deze studie wordt ondersteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (projectnummer 41476147) en de Onderzoeksraad van de speciale administratieve regio Hongkong, China (projectnummers 689813 en 16103414) in verleent.
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referencias
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
