Fotobranqueamento permite Super-resolução imagem do anel FtsZ a associação ficobilinas
Summary
Aqui nós descrevemos um método fotobranqueamento para reduzir a autofluorescência de cianobactérias. Depois fotobranqueamento, microscopia de reconstrução óptica estocástico é usada para obter imagens tridimensionais de super-resolução do anel FtsZ cianobactérias.
Abstract
Microscopia de super-resolução tem sido amplamente utilizada para o estudo das interações da proteína e estruturas subcelulares em muitos organismos. Em organismos fotossintéticos, no entanto, a resolução lateral da imagem latente de super-resolução é apenas ~ 100 nm. A baixa resolução é principalmente devido à alta autofluorescência fundo das células fotossintéticas causada por lasers de alta intensidade que são necessários para a imagem latente de super-resolução, tais como a microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade). Aqui, descrevemos um assistida fotobranqueamento tempestade método que foi desenvolvido recentemente para o picocyanobacterium marinho ficobilinasde imagem. Após fotobranqueamento, a autofluorescência de ficobilinas efetivamente é reduzida assim que a tempestade pode ser realizada com uma resolução lateral de ~ 10 nm. Usando este método, podemos adquirir a organização na vivo tridimensional (3D) da proteína FtsZ e caracterizar quatro diferentes morfologias de anel FtsZ durante o ciclo celular de ficobilinas. O método que descrevemos aqui pode ser adotado para o tratamento de imagens de super-resolução de outros organismos fotossintéticos.
Introduction
Microscopies de super-resolução podem quebrar o limite de difração de luz e fornecer imagens dentro de resoluções de difração sub (< 200 nm). Eles têm sido amplamente utilizados em muitos organismos para estudar a localização da proteína e estruturas subcelulares. Major Super-resolução microscopia métodos incluem iluminação estruturada microscopia (SIM), estimulou a microscopia de depleção de emissão (STED), tempestade e microscopia de localização fotoativados (PALM). Os mecanismos e aplicações destes super-resolução microscópios foram revisaram em outro lugar1,2.
TEMPESTADE pode alcançar uma resolução tão alta quanto 10 nm por separação espacial3,4. Para tempestade, somente uma molécula dentro de uma região de difração limitada é ativada (“on”) e o resto das moléculas são mantidas inactivada (“off”). Pelo acúmulo de ligar rápido e – fora de moléculas simples, uma imagem “difração-ilimitado” pode ser gerado3. Entretanto, muitos tipos de corantes orgânicos e proteínas fluorescentes são aplicáveis na tempestade, permitindo uma atualização fácil de microscopia de fluorescência regular para microscopia de alta resolução5,6.
TEMPESTADE não tem sido amplamente aplicada em células fotossintéticas, como cianobactérias, algas, e células vegetais com cloroplastos7,8, que é devido ao fato de que a tempestade requer intensidade elevada do laser para unidade photoswitching. O laser de alta intensidade desfavoravelmente excita autofluorescência forte fundo nas células fotossintéticas e interfere com a localização do único-molécula em imagem de tempestade. Para usar a tempestade para investigar as estruturas subcelulares ou interações da proteína nas células fotossintéticas, desenvolvemos um protocolo de fotobranqueamento para saciar o fundo autofluorescência sinais9. Em um procedimento de coloração imunofluorescente rotina, amostras são expostas a luz branca de alta intensidade durante a etapa de bloqueio, o que reduz a autofluorescência de células fotossintéticas para cumprir as exigências para a tempestade. Assim, este protocolo torna viável para investigar organismos pigmentados com tempestade.
Aqui, descrevemos o protocolo para usar a tempestade a imagem da organização de anel FtsZ no picocyanobacterium unicelular ficobilinas. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto altamente conservada de tubulina, como que se polimeriza para formar uma estrutura em anel (o anel Z) em torno da circunferência de uma célula10 e é essencial para a divisão celular11. Preservado ficobilinas células são primeira foto para reduzir a autofluorescent fundo e immunostained com um anticorpo primário anti-FtsZ, e em seguida um anticorpo de IgG (H + L) de antisecundário coelho é conjugado com um fluoróforo (por exemplo, , Alexa Fluor 750). Eventualmente, a tempestade é usado para observar as organizações de anel FtsZ detalhadas em ficobilinas durante fases do ciclo celular diferente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, descrevemos um procedimento para reduzir significativamente a autofluorescência da Associação ficobilinas (Figura 3) e, em seguida, delgados das proteínas nas células, que nos permitiram utilizar tempestade para estudar a FtsZ 3D morfologias anel em ficobilinas (Figura 4). Este protocolo pode ser adotado para a imagem latente de super-resolução em outros organismos fotossintéticos.
Estudos an…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Daiying Xu para a assistência técnica e comentários sobre o manuscrito. Este estudo é suportado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (número do projeto 41476147) e Conselho de bolsas de investigação de Hong Kong região administrativa especial, China (números do projeto, 689813 e 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referencias
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