Photobleaching permette l'Imaging a Super-risoluzione dell'anello FtsZ nel cianobatterio Prochlorococcus
Summary
Qui descriviamo un metodo photobleaching per ridurre l’autofluorescenza di cianobatteri. Dopo photobleaching, microscopia stocastico ricostruzione ottico viene utilizzata per ottenere immagini tridimensionali ad alta super-risoluzione dell’anello FtsZ cianobatterica.
Abstract
Microscopia di Super-risoluzione è stato ampiamente utilizzata per studiare le interazioni della proteina e strutture subcellulari in molti organismi. Negli organismi fotosintetici, tuttavia, la risoluzione laterale dell’imaging di Super-risoluzione è solo ~ 100 nm. La bassa risoluzione è dovuto principalmente sullo sfondo di alta autofluorescenza delle cellule fotosintetiche causato da laser ad alta intensità che sono necessari per l’imaging di Super-risoluzione, come il microscopio stocastico ricostruzione ottico (tempesta). Qui, descriviamo un assistita photobleaching tempesta metodo che è stato sviluppato recentemente per formazione immagine il picocyanobacterium marino Acinetobacter. Dopo photobleaching, l’autofluorescenza di Acinetobacter è efficacemente ridotto così quella tempesta può essere eseguita con una risoluzione laterale di ~ 10 nm. Utilizzando questo metodo, acquisiamo l’organizzazione in vivo tridimensionale (3D) della proteina FtsZ e caratterizzano le quattro diverse morfologie di anello di FtsZ durante il ciclo cellulare di Acinetobacter. Il metodo che qui descritto potrebbe essere adottato per l’imaging di Super-risoluzione di altri organismi fotosintetici.
Introduction
Microscopie di Super-risoluzione possono rompere il limite di diffrazione di luce e di fornire immagini all’interno di risoluzioni Sub-diffrazione (< 200 nm). Essi sono stati ampiamente utilizzati in molti organismi per studiare la localizzazione della proteina e strutture subcellulari. Maggiore super-risoluzione microscopia metodi includono illuminazione strutturata microscopia (SIM), stimolato microscopia di svuotamento di emissione (STED), tempesta e microscopia di fotoattivazione localizzazione (PALM). I meccanismi e le applicazioni di questi super-risoluzione microscopi sono stati esaminati altrove1,2.
TEMPESTA può raggiungere una risoluzione alta come 10 nm di separazione spaziale3,4. Per la tempesta, soltanto una molecola all’interno di una regione di diffrazione limitata è attivo (“on”) e il resto delle molecole sono tenute inattivato (“off”). Da un accumulo di accensione rapida e – off di singole molecole, un’immagine “diffrazione-illimitato” può essere generato3. Nel frattempo, molti tipi di coloranti organici e proteine fluorescenti sono applicabili in tempesta, permettendo un facile aggiornamento da microscopia di fluorescenza regolari a microscopia ad alta risoluzione5,6.
TEMPESTA non è stato ampiamente applicato in cellule fotosintetiche, come cianobatteri, alghe, e cellule vegetali con cloroplasti7,8, che è dovuto al fatto che la tempesta richiede laser ad alta intensità per unità photoswitching. Il laser ad alta intensità sfavorevole eccita autofluorescence forte background in cellule fotosintetiche e interferisce con la localizzazione di singola molecola nell’imaging di tempesta. Per poter utilizzare tempesta per indagare le strutture subcellulari o interazioni della proteina in cellule fotosintetiche, abbiamo sviluppato un protocollo di photobleaching per placare lo sfondo autofluorescence segnali9. In una procedura di macchiatura immunofluorescente routine, gli esemplari sono esposti a luce bianca di alta intensità durante la fase di blocco, che abbassa l’autofluorescenza delle cellule fotosintetiche per soddisfare i requisiti per la tempesta. Così, questo protocollo rende fattibile per studiare gli organismi pigmentati con tempesta.
Qui, descriviamo il protocollo da utilizzare tempesta all’immagine dell’organizzazione di anello FtsZ nella picocyanobacterium unicellulari Acinetobacter. FtsZ è una proteina del citoscheletro altamente conservata di tubulina-come che polimerizza per formare una struttura ad anello (l’anello Z) lungo la circonferenza di una cella10 ed è essenziale per la divisione cellulare11. Cellule sono conservate Prochlorococcus prima photobleached per ridurre la priorità bassa autofluorescent e immunostained con un anticorpo primario anti-FtsZ, e poi un anticorpo di IgG (H + L) anti-coniglio secondario è coniugato con un fluoroforo (per esempio. , Alexa Fluor 750). Alla fine, tempesta è usato per osservare le organizzazioni di anello di FtsZ dettagliate in Acinetobacter durante le fasi di ciclo cellulare diverso.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura per ridurre significativamente l’autofluorescenza del cianobatterio Prochlorococcus (Figura 3) e, quindi, immunostain le proteine nelle cellule, che ci ha permesso di utilizzare tempesta per studiare il FtsZ 3D morfologie di anello in Acinetobacter (Figura 4). Questo protocollo potrebbe essere adottato per l’imaging di Super-risoluzione in altri organismi fotosintetici.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Daiying Xu per la sua assistenza tecnica e commenti sul manoscritto. Questo studio è supportato da sovvenzioni da National Natural Science Foundation of China (progetto numero 41476147) e Consiglio concede, ricerca della regione amministrativa speciale di Hong Kong, Cina (numeri di progetto 689813 e 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referencias
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
