Photobleaching מאפשר הדמיה ברזולוציה-העל של הטבעת FtsZ Cyanobacterium Prochlorococcus
Summary
כאן נתאר שיטת photobleaching כדי להפחית את autofluorescence של כחוליות. לאחר photobleaching, שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ משמשת כדי לקבל תמונות סופר-ברזולוציה תלת מימדי של הטבעת FtsZ cyanobacterial.
Abstract
מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כבר בשימוש נרחב ללמוד אינטראקציות חלבון ומבנים subcellular אורגניזמים רבים. אורגניזמים פוטוסינתטיים, עם זאת, הרזולוציה לרוחב של הדמיה סופר-ברזולוציה הוא רק 100 ~ ננומטר. הרזולוציה הנמוכה נובעת בעיקר רקע autofluorescence גבוהה של תאים פוטוסינתטיים הנגרמת על ידי לייזר בעוצמה גבוהה הנדרשים עבור הדמיה ברזולוציה סופר, כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה). כאן, אנו מתארים בסיוע photobleaching סערה שיטה אשר פותחה לאחרונה הדמיה של picocyanobacterium ימי Prochlorococcus. לאחר photobleaching, autofluorescence של Prochlorococcus ביעילות פוחת כך הסערה יכול להתבצע עם רזולוציה לרוחב של ~ 10 ננומטר. באמצעות שיטה זו, אנו רוכשים הארגון ויוו תלת-ממדיים (3-D) של החלבון FtsZ, לאפיין את ארבעת מורפולוגיות טבעת FtsZ שונים במהלך מחזור התא של Prochlorococcus. השיטה שנתאר כאן עשוי להיות מאומץ על ההדמיה סופר רזולוציה של אורגניזמים פוטוסינתטיים אחרים.
Introduction
Microscopies סופר רזולוציה ניתן לשבור את מגבלת עקיפה של אור, לספק תמונות תוך עקיפה משנה החלטות (< 200 ננומטר). הם היה בשימוש נרחב אורגניזמים רבים ללמוד חלבון לוקליזציה ומבנים subcellular. רס ן סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה כוללים תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM), גירוי פליטה דלדול מיקרוסקופ (STED), סופה ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל). מנגנוני והיישומים של אלה רזולוציה סופר מיקרוסקופים כבר בדקתי במקומות אחרים1,2.
סופה ניתן להשיג רזולוציה גבוהה כמו 10 ננומטר על ידי הפרדה מרחבית3,4. . סטורם, מולקולה אחת בלבד בתוך אזור מוגבל עקיפה מופעל (“על”), השאר של המולקולות נשמרים מוחלש (“off”). על ידי הצטברות של מתג מהיר- לסירוגין – מולקולות יחיד, תמונת “עקיפה-בלתי מוגבל” יכול להיות שנוצר3. בינתיים, סוגים רבים של צבעי אורגניות וחלבונים פלורסנט ישימות בסערה, המאפשרת שדרוג קל של קרינה פלואורסצנטית רגילה מיקרוסקופ מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה5,6.
הסערה לא הוחל נרחב תאים פוטוסינתטיים, כגון כחוליות, אצות, ודורש תאי צמחים עם מהכלורופלסט7,8, אשר בשל העובדה הסערה עוצמת הלייזר גבוהה כדי נסיעה photoswitching. הלייזר בעוצמה גבוהה בעלת מרגש רקע חזק autofluorescence תאים פוטוסינתטיים, מפריע לוקליזציה מולקולה בודדת בתחום ההדמיה סערה. על מנת להשתמש סערה לחקור את המבנים subcellular או אינטראקציות חלבון תאים פוטוסינתטיים, פיתחנו פרוטוקול photobleaching כדי להרוות את אותות autofluorescence רקע9. במסגרת הליך שגרתי immunofluorescent מוכתמים, דגימות נחשפים אור לבן בעוצמה גבוהה במהלך השלב חסימה, אשר מוריד את autofluorescence של תאים פוטוסינתטיים כדי לעמוד בדרישות סערה. לפיכך, פרוטוקול זה הופך ריאלי לחקור אורגניזמים פיגמנט עם הסערה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שישמש סערה תמונת הארגון טבעת FtsZ picocyanobacterium חד־תאיות Prochlorococcus. FtsZ הוא מאוד שנשמרת טובולין דמוי cytoskeletal חלבון אשר polymerizes כדי ליצור מבנה הטבעת (הטבעת Z) סביב היקף התא10 הוא חיוני עבור ה11של חלוקת התא. נשמר Prochlorococcus תאים הן photobleached הראשון כדי להפחית את הרקע autofluorescent ואת immunostained עם נוגדן anti-FtsZ העיקרי, ואז נוגדנים IgG (H + L) משני הארנב אנטי מצומדת עם fluorophore (למשל , אלקסה עבור חיל הים 750). בסופו של דבר, סערה משמשת להתבוננות הארגונים מפורטת של הטבעת FtsZ ב Prochlorococcus בשלבים שונים של מחזור התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנו המתואר הליך כדי להפחית באופן משמעותי את autofluorescence של cyanobacterium Prochlorococcus (איור 3C) ו, אז, immunostain החלבונים בתאים, שאיפשר לנו לנצל את סטורם ללמוד את FtsZ תלת-ממדי טבעת מורפולוגיות ב- Prochlorococcus (איור 4). פרוטוקול זה עשוי להיות מאומץ עבור הדמיה ס?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Daiying Xu על לה סיוע טכני והערות על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מספר הפרוייקט 41476147) המועצה מענקים למחקר של הונג קונג אזור מנהלי מיוחד, סין (פרוייקט מספרים 689813 ו- 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referencias
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
