Photobleaching Cyanobacterium Prochlorococcus FtsZ ringde Süper çözünürlük görüntüleme sağlar
Summary
Burada Siyanobakteriler autofluorescence azaltmak için photobleaching yöntemi açıklanmaktadır. Photobleaching sonra Stokastik optik imar mikroskobu siyanobakteriyel FtsZ ringin üç boyutlu Süper çözünürlük fotoğraf elde etmek için kullanılır.
Abstract
Süper çözünürlük mikroskobu protein etkileşimleri ve çoğu canlıda hücre altı yapıları incelemek için yaygın olarak kullanılmış. Fotosentetik canlılar arasında süper kararlılık düşsel yanal çözünürlük sadece 100 ~ be nm. Düşük çözünürlük çok yüksek autofluorescence hücrelerin arka planını Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) gibi süper kararlılık düşsel için gerekli olan yüksek yoğunluklu lazerler neden fotosentetik kaynaklanmaktadır. Burada, deniz picocyanobacterium Prochlorococcusgörüntüleme için son zamanlarda geliştirilen bir photobleaching destekli fırtına yöntemi açıklanmaktadır. O fırtına ~ 10 yanal çözünürlük ile yapılabilir böylece photobleaching sonra etkili bir şekilde Prochlorococcus autofluorescence azalır nm. Bu yöntemi kullanarak, biz vivo içinde üç boyutlu (3-D) organizasyon FtsZ protein elde etmek ve Prochlorococcushücre döngüsü sırasında dört farklı FtsZ yüzük türleri morfoloji karakterize. Biz burada tarif yöntemi fotosentetik diğer organizmaların süper kararlılık düşsel için kabul edilebilir.
Introduction
Süper çözünürlük microscopies ışığın kırınım sınırını kırmak ve alt kırınım çözünürlükleri (< 200 nm) içinde görüntüler sunar. Bunlar yaygın birçok organizmalarda protein yerelleştirme ve hücre altı yapıları incelemek için kullanılmıştır. Binbaşı Süper çözünürlük mikroskobu yöntemleri arasında yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED), fırtına ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM). Mekanizmaları ve mikroskoplar olmuştur bu süper çözünürlük uygulamaları başka bir yerde1,2gözden geçirdim.
FIRTINA 10’a kadar yüksek bir çözünürlük elde edebilirsiniz nm uzaysal ayırma3,4. FIRTINA, bir kırınım-sınırlı bölge içinde tek bir molekül (“on”) etkinleştirilir ve molekülleri kalan (“uzak”) Inaktif tutulur. Bir birikimi hızlı geçiş on ve – off tek moleküller tarafından oluşturulan3“kırınım-sınırsız” bir görüntü olabilir. Bu arada, birçok türde organik boya ve floresan proteinler yüksek çözünürlüklü mikroskobu5,6düzenli floresans mikroskobu kolay bir yükseltme izin fırtınada tabidir.
FIRTINA geniş Siyanobakteriler, yosun, gibi fotosentetik hücrelerdeki uygulanmamış ve bitki hücreleri ile kloroplast7,ki…… fırtına nedeni olan8, sürücü photoswitching için yüksek lazer yoğunluğu gerektirir. Yüksek yoğunluktaki lazer olumsuz ve güçlü autofluorescence arka planda fotosentetik hücreleri heyecanlandıran tek molekül yerelleştirme fırtına görüntülemede etkilemektedir. FIRTINA hücre altı yapıları veya protein etkileşimleri fotosentetik hücrelerdeki araştırmak için kullanmak için arka plan autofluorescence sinyalleri9gidermek için photobleaching iletişim kuralı geliştirilmiştir. Rutin bir immünfloresan boyama işlem içinde numuneler fotosentetik hücrelerinin fırtına gereksinimlerini autofluorescence düşürür engelleme adım sırasında yüksek yoğunluklu beyaz ışığa maruz kalır. Böylece, bu iletişim kuralını fırtına ile pigmentli organizmalar araştırmak için uygun yapar.
Burada, tek hücreli picocyanobacterium ProchlorococcusFtsZ yüzük kuruluşta görüntüye fırtına kullanılacak protokol açıklayın. FtsZ hücre10 çevresi halka yapısının (Z halka) oluşturmak için polymerizes ve hücre bölünmesi11için gerekli olan bir son derece korunmuş tübülin benzeri hücre iskeleti proteindir. Prochlorococcus korunmuş hücrelerdir autofluorescent arka plan ve immunostained bir birincil anti-FtsZ antikor ile azaltmak için ilk photobleached ve sonra ikincil bir anti-tavşan (H + L) IgG antikor fluorophore ile Birleşik (Örneğin , Alexa Fluor 750). Sonunda, fırtına Prochlorococcus detaylı FtsZ yüzük kuruluşlarda farklı hücre döngüsü aşamaları sırasında gözlemlemek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için biz cyanobacterium Prochlorococcus (Şekil 3 c) autofluorescence önemli ölçüde azaltmak için bir prosedür açıklanan ve daha sonra immunostain 3-b FtsZ çalışmaya fırtına kullanmak için bize etkin hücre proteinleri Yüzük türleri morfoloji olarak Prochlorococcus (Şekil 4). Bu iletişim kuralı için süper kararlılık düşsel fotosentetik diğer organizmalarda kabul.
Fotosentetik c…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Daiying Xu onun teknik yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, Çin’den (proje numarası 41476147) hibe ve araştırma hibe Konseyi, Hong Kong özel idari bölgesi, Çin (proje numaraları 689813 ve 16103414) tarafından desteklenir.
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referencias
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
