Фотообесцвечивание позволяет супер резолюции изображений FtsZ кольца в цианобактерии Prochlorococcus
Summary
Здесь мы описываем метод Фотообесцвечивание для снижения аутофлюоресценция цианобактерий. После Фотообесцвечивание стохастический оптических реконструкции микроскопии используется для получения изображений трехмерных суперразрешением цианобактерий кольца FtsZ.
Abstract
Супер-резолюции микроскопии широко использовался для изучения взаимодействия протеина и внутриклеточных структур многих организмов. В фотосинтетических организмов, однако, латеральное разрешение суперразрешением изображений является только ~ 100 Нм. Низкое разрешение обусловлено главным образом высоким аутофлюоресценция фон фотосинтезирующих клеток, вызванные лазеров высокой интенсивности, которые необходимы для супер-резолюции изображений, таких как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм). Здесь мы описываем при содействии Фотообесцвечивание шторм метод который была разработана недавно для изображений морской picocyanobacterium Prochlorococcus. После Фотообесцвечивание, Аутофлюоресценция Prochlorococcus эффективно снижается так что шторм может быть выполнена с латеральное разрешение ~ 10 Нм. С помощью этого метода, мы приобретаем в vivo трехмерной (3-D) Организации FtsZ белка и характеризуют четыре различных FtsZ кольцо морфологии во время цикла клетки Prochlorococcus. Метод, который мы описываем здесь могут быть приняты для супер-резолюции изображений других фотосинтетических организмов.
Introduction
Суперразрешением microscopies может нарушить дифракционный предел света и предоставляют изображения в рамках резолюций Подкомиссии дифракции (< 200 Нм). Они широко используются во многих организмах для изучения белков локализации и внутриклеточных структур. Основные суперразрешением микроскопии методы включают структурированного освещения микроскопии (SIM), стимулировали выбросов истощения микроскопии (интереса), шторм и photoactivated локализации микроскопии (PALM). 1,2обзор других механизмов и применения этих супер-резолюции, которые были микроскопы.
ШТОРМ может достичь резолюции аж 10 Нм, пространственное разделение3,4. Для ШТОРМА только одна молекула в регион дифракционный активируется («по») и остальная часть молекулы хранятся инактивированных («выключено»). Накоплением быстрого переключения на и – офф одной молекулы «дифракционный Безлимитный» изображение может быть сгенерированный3. Между тем многие виды органических красителей и флуоресцентные белки применимы в шторм, что позволяет легко модернизировать от регулярных флуоресцентной микроскопии высокого разрешения микроскопии5,6.
ШТОРМ не применяется широко в фотосинтезирующих клеток, таких как синезеленых водорослей, морских водорослей, и растительных клеток с хлоропластов7,8, которая обусловлена тем, что шторм требует высокой лазерной интенсивности для привода photoswitching. Высокой интенсивности лазерного неблагоприятно возбуждает аутофлюоресценция сильный фон в фотосинтезирующих клеток и препятствует сингл молекула локализации в шторм изображений. Чтобы использовать шторм расследовать внутриклеточных структур или белковых взаимодействий в фотосинтезирующих клеток, мы разработали протокол Фотообесцвечивание чтобы утолить фон аутофлюоресценция сигналы9. В процедуре обычной immunofluorescent окрашивания образцов подвергаются белый свет высокой интенсивности во время блокировки шага, который понижает аутофлюоресценция фотосинтезирующих клеток для удовлетворения требований для ШТОРМА. Таким образом этот протокол делает возможным расследовать пигментированной организмов с ШТОРМОМ.
Здесь мы описываем протокол использовать ШТОРМА для изображений FtsZ кольцо Организации одноклеточных picocyanobacterium Prochlorococcus. FtsZ является весьма сохранены тубулин как цитоскелета белком, который polymerizes сформировать структуру кольцо (кольцо Z) по окружности ячейки10 и имеет важное значение для деления клеток11. Сохранились Prochlorococcus клетки первого photobleached уменьшить фон autofluorescent и immunostained с основных анти FtsZ антитела, и затем вторичные антитела IgG (H + L) анти кролик проспряганное с Флюорофор (например , Alexa Fluor 750). В конце концов шторм используется для наблюдать подробную FtsZ кольцо организаций в Prochlorococcus стадии различных клеточного цикла.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, мы описали процедура значительно сократить аутофлюоресценция цианобактерии Prochlorococcus (рис. 3 c) и, затем, имунноконтраст белков в клетках, которые позволили нам использовать шторм для того чтобы изучить 3-D FtsZ кольцо морфологии в Prochlorococcus (<strong class=…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Daiying Xu за ее техническую помощь и комментарии на рукопись. Это исследование поддерживается гранты от Фонда национального естественных наук Китая (номер 41476147 проекта) и научно-исследовательских грантов Советом Специального административного района Гонконг, Китай (номера проектов 689813 и 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referencias
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
