Fotoblanqueo permite proyección de imagen de súper-resolución del anillo de FtsZ en la cianobacteria Prochlorococcus
Summary
Aquí se describe un método de fotoblanqueo para reducir la autofluorescencia de las cianobacterias. Después de photobleaching, microscopia óptica estocástica de la reconstrucción se utiliza para obtener imágenes de resolución súper tridimensional del anillo de FtsZ cianobacterias.
Abstract
Microscopía de superresolución ha sido ampliamente utilizado para el estudio de las interacciones entre proteínas y estructuras subcelulares en muchos organismos. En organismos fotosintéticos, sin embargo, la resolución lateral de proyección de imagen de súper-resolución es sólo de ~ 100 nm. La baja resolución es principalmente debido al fondo de la autofluorescencia alta de células fotosintéticas causados por rayos láser de alta intensidad que se requieren para la proyección de imagen de súper-resolución, tales como microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta). Aquí, describimos un asistida por photobleaching tormenta método desarrollado recientemente para la proyección de imagen la picocyanobacterium Marina Prochlorococcus. Después de photobleaching, el autofluorescence de Prochlorococcus es reducido por lo que la tormenta se puede realizar con una resolución lateral de ~ 10 nm. Usando este método, adquiere la organización en vivo tridimensional (3D) de la proteína FtsZ y caracterizar cuatro diferentes morfologías de anillo de FtsZ durante el ciclo celular de Prochlorococcus. El método que se describe aquí puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.
Introduction
Microscopías de super-resolución pueden romper el límite de difracción de la luz y proporcionan imágenes en resoluciones de la secundario-difracción (< 200 nm). Han sido ampliamente utilizados en muchos organismos para estudiar la localización de proteínas y estructuras subcelulares. Grandes súper resolución microscopia métodos incluyen microscopía de iluminación estructurada (SIM), estimuló la microscopia de agotamiento de la emisión (STED), tormenta y microscopía de localización fotoactivado (PALM). Los mecanismos y aplicaciones de estos súper-resolución microscopios han sido revisaron en otra parte1,2.
TORMENTA puede alcanzar una resolución tan alta como 10 nm por separación espacial3,4. Para la tormenta, solamente una molécula dentro de una región limitada de la difracción está activada (“on”) y el resto de las moléculas se mantienen inactiva (“off”). Por una acumulación de encendido rápido y – de las moléculas individuales, una imagen “difracción ilimitado” puede ser generado3. Mientras tanto, muchas clases de colorantes orgánicos y proteínas fluorescentes son aplicables en la tormenta, lo que permite una fácil actualización de microscopía de fluorescencia regular a microscopía de alta resolución5,6.
TORMENTA no se ha aplicado extensamente en células fotosintéticas, como cianobacterias, algas y células vegetales con cloroplastos7,8, que es debido al hecho de la tormenta requiere intensidad de láser de alta a la unidad photoswitching. El láser de alta intensidad desfavorable excita autofluorescence fuerte fondo en células fotosintéticas e interfiere con la localización de una sola molécula en proyección de imagen de la tormenta. Para poder utilizar tormenta para investigar las estructuras subcelulares o interacciones de la proteína en células fotosintéticas, hemos desarrollado un protocolo fotoblanqueo para calmar el fondo autofluorescence señales9. En un procedimiento rutinario de tinción inmunofluorescente, ejemplares están expuestos a la luz blanca de alta intensidad durante la etapa de bloqueo que reduce el autofluorescence de células fotosintéticas para cumplir los requisitos para la tormenta. Así, este protocolo hace posible investigar organismos pigmentados con tormenta.
Aquí, describimos el protocolo para usar la tormenta a la imagen de la organización del anillo de FtsZ en la picocyanobacterium unicelular Prochlorococcus. FtsZ es una proteína citoesquelética altamente conservada de tubulina-como que se polimeriza para formar una estructura de anillo (el anillo Z) alrededor de la circunferencia de un celular de10 y es esencial para la división celular11. Conserva Prochlorococcus células son primer photobleached para reducir el fondo autofluorescent y immunostained con un anticuerpo primario anti-FtsZ, y entonces un anticuerpo de IgG (H+L) de anti-conejo secundario se conjuga con un fluoróforo (p. ej. , Alexa Fluor 750). Finalmente, la tormenta se utiliza para observar a las organizaciones detalladas de anillo de FtsZ en Prochlorococcus en etapas del ciclo de la célula diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe un procedimiento para reducir significativamente la autofluorescencia de la cianobacteria Prochlorococcus (figura 3) y, luego, immunostain las proteínas en las células, que nos permitieron utilizar tormenta para estudiar la FtsZ 3D morfologías de anillo en Prochlorococcus (figura 4). Este protocolo puede adoptarse para la proyección de imagen de súper-resolución de otros organismos fotosintéticos.
<p cl…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen Daiying Xu por su asistencia y comentarios sobre el manuscrito. Este estudio es apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número de proyecto 41476147) y el Consejo de becas de investigación de la región administrativa especial Hong Kong, China (números de proyecto 689813 y 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referencias
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