Repetitieve bloedafname uit de subclavia-ader van bewuste rat
Summary
Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor het verzamelen van bloed uit de subclavia-ader bij ratten. Het maakt snelle, tijdige en gemakkelijk identificeerbare bemonstering zonder anesthesie mogelijk en verkrijgt bloed van hoge kwaliteit door herhaalde monsterverzameling.
Abstract
Ratten worden veel gebruikt in farmacokinetiek (PK) en toxicokinetische (TK) studies die een bepaalde hoeveelheid bloed op specifieke tijdstippen moeten verzamelen om blootstelling aan geneesmiddelen te detecteren. De rattenbloedafnamemethode bepaalt de kwaliteit van het plasma en beïnvloedt verder de precisie van de testresultaten. De subclavia-aderbloedafnamemethode die in dit protocol wordt beschreven, verzamelt bloedmonsters herhaaldelijk in de bewuste toestand van dieren om te voldoen aan de behoeften van PK- en TK-tests. De vaardigheden van terughoudendheid en de juiste procedure van naaldincisie zorgen voor het succespercentage van bloedafname. Het is eenvoudig te bedienen terwijl de kwaliteit van plasma wordt gewaarborgd en tegelijkertijd rekening wordt gehouden met dierenwelzijn. Deze methode vereist echter een bekwame bediening en een onjuiste methode kan dierlijke zwakte, pijn, kreupelheid en zelfs sterfte veroorzaken. De huidige methode is gebruikt in de testfaciliteit voor een orale toxiciteitsstudie van 4 weken bij Sprague Dawley (SD) ratten met TK. De maximale hoeveelheid bloed die binnen 24 uur werd verzameld, bedroeg niet meer dan 20% van het totale bloed van het dier. Het lichaamsgewicht van de dieren was meer dan 200 g voor mannetjes en vrouwtjes. De gegevens toonden aan dat het lichaamsgewicht van de dieren elke week gestaag toenam en de klinische observatie normaal was na herhaalde monsterverzameling.
Introduction
Volgens de Richtlijnen1 van de International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) en de richtlijnen van de National Medical Products Administration (NMPA)2, moet het aantal bloedafnametijdpunten van ratten in de toxicokinetische (TK) studie voldoen aan de vereisten van de dynamische beoordeling van de blootstelling aan geneesmiddelen. Het geschatte totale bloedvolume van een rat is 55-70 ml / kg lichaamsgewicht3. De verzameltijdpunten zijn over het algemeen intensief binnen 30 minuten na toediening en nemen daarna af, en meer dan tien bloedmonsters moeten binnen 48 uur worden verzameld bij routinetests4. Bloedmonsters worden bijvoorbeeld verzameld op 12-tijdstippen (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h en 12 h) in TK-onderzoek van oraal toegediende geneesmiddelen. Onderzoekers moeten herhaaldelijk 200-250 μL bloed bij ratten verzamelen om plasma van hoge kwaliteit te verkrijgen voor de TK-test5.
De bloedafnameplaatsen bij ratten omvatten staartbloedvaten, retro-orbitale plexusader, submandibulaire ader, hart, abdominale aorta6, enzovoort. Onder hen is bloedafname uit de caudale ader van ratten een veelgebruikte methode, waarvoor ervaren en bekwame operators nodig zijn 7,8. Het verzamelen van bloed uit de retro-orbitale plexusader is minder ingewikkeld; deze methode wordt echter niet aanbevolen omdat het het gezichtsvermogen van de ratten kan beschadigen9, en bloed uit het hart en de abdominale aorta is alleen geschikt voor de uiteindelijke bloedafname10. Een andere methode voor het verzamelen van bloed uit de submandibulaire ader bij een bewuste rat heeft aangetoond dat dit tot meer complicaties leidt en onvoldoende bloedmonsterkwaliteitaan het licht brengt 11. Daarom kunnen onderzoekers het dier verdoven om de moeilijkheid van bemonstering te verminderen. Toch verhoogt de anesthesie ook de kosten van het experiment, en ernstiger, het zal de metabole toestand van ratten beïnvloeden12. Het huidige protocol maakt gebruik van een snelle en eenvoudige methode voor het verzamelen van bloed in de subclavia-aderen van ratten zonder anesthesie, waardoor nauwkeurige positionering en bilaterale afwisselende bloedafname mogelijk is om tijdig en herhaald monsters van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn bepaalde voordelen van het verzamelen van bloed uit de aderen van de subclavia. (1) Omdat de plaats van de bloedafname gemakkelijk wordt gedissocieerd en de veneuze plexus niet regelmatig is vanwege de verschillende houdingen van de ratten, kan de beschreven methode gemakkelijk de positie van de veneuze plexus lokaliseren met behoud van de stabiele en comfortabele houdingen van de ratten. (2) De bediening is eenvoudig en gunstig voor de snelle ontwikkeling van de vaardigheden van technici en minder pijn voor dier…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) en Key Program “New Drug Creation” van Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 en No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referencias
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
