Bilinçli Sıçan Subklaviyen Veninden Tekrarlayan Kan Örneklemesi
Summary
Mevcut protokol, sıçanlarda subklaviyen damardan kan toplamak için basit ve etkili bir yöntemi açıklamaktadır. Anestezi olmadan hızlı, zamanında ve kolayca tanımlanabilir örnekleme sağlar ve tekrarlayan numune toplama yoluyla yüksek kaliteli kan elde eder.
Abstract
Sıçanlar, ilaca maruz kalmayı tespit etmek için belirli zaman noktalarında belirli miktarda kan toplaması gereken farmakokinetiği (PK) ve toksikokinetik (TK) çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Sıçan kan örnekleme yöntemi, plazmanın kalitesini belirler ve test sonuçlarının hassasiyetini daha da etkiler. Bu protokolde açıklanan subklaviyen ven kan toplama yöntemi, PK ve TK testlerinin ihtiyaçlarını karşılamak için hayvanların bilinçli durumlarında tekrar tekrar kan örnekleri toplar. Kısıtlama işleme becerileri ve uygun iğne kesisi prosedürü kan alımının başarı oranını sağlar. Plazma kalitesini sağlarken ve aynı zamanda hayvan refahını karşılarken kullanımı kolaydır. Bununla birlikte, bu yöntem yetenekli bir operasyon gerektirir ve uygun olmayan bir yöntem hayvan zayıflığına, ağrıya, topallığa ve hatta ölümlere neden olabilir. Mevcut yöntem, TK’lı Sprague Dawley (SD) sıçanlarında 4 haftalık bir oral toksisite çalışması için test tesisinde kullanılmıştır. 24 saat içinde toplanan maksimum kan miktarı, hayvanın toplam kanının% 20’sini geçmedi. Hayvanların vücut ağırlığı erkekler ve dişiler için 200 g’dan fazlaydı. Veriler, hayvanların vücut ağırlığının her hafta istikrarlı bir şekilde arttığını ve tekrarlayan numune toplamadan sonra klinik gözlemin normal olduğunu gösterdi.
Introduction
İnsan Kullanımı İçin İlaçların Tescili için Teknik Gereksinimlerin Uyumlaştırılması Uluslararası Konferansı (ICH) kılavuzları1 ve Ulusal Tıbbi Ürünler İdaresi (NMPA) kılavuzları2’ye göre, toksikokinetik (TK) çalışmadaki sıçanların kan toplama zaman noktalarının sayısının, dinamik ilaca maruz kalma değerlendirmesinin gereksinimlerini karşılaması gerekir. Bir sıçanın yaklaşık toplam kan hacmi 55-70 mL / kg vücut ağırlığı3’tür. Toplama zaman noktaları genellikle dozlamadan sonraki 30 dakika içinde yoğundur ve bundan sonra azalır ve rutin testlerde 48 saat içinde ondan fazla kan örneğinin toplanması gerekir4. Örneğin, kan örnekleri, oral yoldan verilen ilaçların TK çalışmasında 12 zaman noktasında (0 dakika, 5 dakika, 10 dakika, 15 dakika, 30 dakika, 45 dakika, 1 saat, 2 saat, 3 saat, 4 saat, 8 saat ve 12 saat) toplanır. Araştırmacılar, TK testi 5 için yüksek kaliteli plazma elde etmek için sıçanlarda tekrar tekrar 200-250 μL kan toplamalıdır.
Sıçanlardaki kan toplama bölgeleri kuyruk kan damarları, retro-orbital pleksus veni, submandibuler ven, kalp, abdominal aort6 vb. İçerir. Bunlar arasında, sıçanların kaudal damarından kan toplanması, deneyimli ve yetenekli operatörler gerektiren sık kullanılan bir yöntemdir 7,8. Retro-orbital pleksus veninden kan toplamak daha az karmaşıktır; Bununla birlikte, bu yöntem sıçanların görme duyusuna zarar verebileceği için önerilmez9 ve kalpten ve abdominal aorttan gelen kan sadece son kan örneklemesi10 için uygundur. Bilinçli bir sıçanda submandibuler damardan kan toplamanın bir başka yönteminin daha fazla komplikasyona neden olduğu ve yetersiz kan örneği kalitesi11 ortaya koyduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, araştırmacılar örnekleme zorluğunu azaltmak için hayvanı uyuşturabilirler. Yine de, anestezi aynı zamanda deneyin maliyetini de arttırır ve daha ciddi olarak, sıçanların metabolik durumunu etkileyecektir12. Mevcut protokol, anestezi olmadan sıçanların subklaviyen damarlarında kan toplamak için hızlı ve basit bir yöntem kullanır, bu da zamanında ve tekrarlanan bir şekilde yüksek kaliteli örnekler elde etmek için doğru konumlandırma ve bilateral alternatif kan alımına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subklaviyen damarlardan kan toplamanın bazı faydaları vardır. (1) Kan toplama bölgesi kolayca ayrıştığından ve sıçanların farklı duruşları nedeniyle venöz pleksus düzenli olmadığından, tarif edilen yöntem, sıçanların stabil ve rahat duruşlarını korurken venöz pleksusun pozisyonunu kolayca lokalize edebilir. (2) Operasyon, teknisyenlerin becerilerinin hızlı gelişimi ve hayvanlara daha az acı vermesi için kolay ve elverişlidir. (3) Hayvanı rahat ettirmek için bir çalışma modu, huzurs…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Guangdong İl İlaç Klinik Olmayan Değerlendirme ve Araştırma Anahtar Laboratuvarı (No.2018B030323024) ve Guangdong Anahtar Araştırma ve Geliştirme Planı Anahtar Programı “Yeni İlaç Oluşturma” (No.2019B020202001), Guangzhou Temel ve Uygulama Vakfı Araştırma Projesi (No.202002030249 ve No.202002030156) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referencias
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
