의식 쥐의 쇄골 하 정맥에서 반복적 인 혈액 샘플링
Summary
본 프로토콜은 쥐의 쇄골 하 정맥으로부터 혈액을 수집하는 간단하고 효율적인 방법을 기술한다. 마취 없이 빠르고 시기적절하며 쉽게 식별할 수 있는 샘플링이 가능하며 반복적인 샘플 수집을 통해 고품질 혈액을 얻을 수 있습니다.
Abstract
쥐는 약물 노출을 감지하기 위해 특정 시점에 일정량의 혈액을 수집해야하는 약동학 (PK) 및 독성 동태 학 (TK) 연구에 널리 사용됩니다. 쥐 혈액 샘플링 방법은 혈장의 품질을 결정하고 테스트 결과의 정밀도에 더 영향을 미칩니다. 이 프로토콜에 설명 된 쇄골 하 정맥 혈액 수집 방법은 PK 및 TK 검사의 요구를 충족시키기 위해 동물의 의식 상태에서 반복적으로 혈액 샘플을 수집합니다. 구속 처리 기술과 바늘 절개의 적절한 절차는 채혈 성공률을 보장합니다. 플라즈마의 품질을 보장하면서 동시에 동물 복지를 제공하면서 작동하기 쉽습니다. 그러나이 방법은 숙련 된 작업이 필요하며 부적절한 방법은 동물의 약점, 통증, 절름발이 및 심지어 사망을 유발할 수 있습니다. 현재 방법은 TK를 가진 Sprague Dawley (SD) 쥐에서 4 주간의 경구 독성 연구를 위해 테스트 시설에서 사용되었습니다. 24 시간 이내에 수집 된 혈액의 최대량은 동물의 총 혈액의 20 %를 초과하지 않았습니다. 동물의 체중은 수컷과 암컷의 경우 200g 이상이었습니다. 데이터는 동물의 체중이 매주 꾸준히 증가한 것으로 나타 났으며 반복적 인 샘플 수집 후 임상 관찰은 정상이었습니다.
Introduction
인체 사용 의약품 등록을위한 기술 요구 사항의 조화에 관한 국제 회의 지침1 및 국가 의약품 관리국 (NMPA) 지침2에 따르면, 독성 동태 학 (TK) 연구에서 쥐의 채혈 시점 수는 동적 약물 노출 평가의 요구 사항을 충족해야합니다. 쥐의 대략적인 총 혈액량은 체중 kg 당 55-70 mL / kg입니다3. 수집 시점은 일반적으로 투여 후 30분 이내에 집중적이고 그 이후에는 감소하며,일상적인 검사에서 48시간 이내에 10개 이상의 혈액 샘플을 수집해야 합니다4. 예를 들어, 혈액 샘플은 경구 투여 약물의 TK 연구에서 12 시간 (0 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 8 시간 및 12 시간)에서 수집됩니다. 연구원은 TK테스트를 위한 고품질 혈장을 얻기 위해 쥐에서 200-250μL의 혈액을 반복적으로 수집해야 합니다5.
쥐의 혈액 수집 부위에는 꼬리 혈관, 역안와 신경총 정맥, 턱밑 정맥, 심장, 복부 대동맥6 등이 포함됩니다. 그 중 쥐의 꼬리 정맥에서 채혈하는 것은 자주 사용되는 방법이며 숙련되고 숙련 된 작업자 7,8이 필요합니다. 후 안와 신경총 정맥에서 혈액을 수집하는 것은 덜 복잡합니다. 그러나 이 방법은 쥐의 시력을 손상시킬 수 있으므로9 권장되지 않으며 심장 및 복부 대동맥의 혈액은 최종 혈액 샘플링10에만 적합합니다. 의식이 있는 쥐의 턱밑 정맥에서 혈액을 수집하는 또 다른 방법은 더 많은 합병증을 유발하는 것으로 나타났으며 혈액샘플 품질이 충분하지 않은 것으로 나타났습니다11. 따라서 연구자들은 샘플링의 어려움을 줄이기 위해 동물을 마취시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 마취는 또한 실험 비용을 증가시키고 더 심각하게는 쥐12의 대사 상태에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 마취없이 쥐의 쇄골 하 정맥에서 혈액을 수집하는 빠르고 간단한 방법을 사용하여 정확한 위치 지정 및 양측 교대 혈액 수집을 가능하게하여시기 적절하고 반복적 인 방식으로 고품질 샘플을 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
쇄골 하 정맥에서 혈액을 수집하는 데에는 몇 가지 이점이 있습니다. (1) 채혈 부위가 쉽게 해리되고 쥐의 자세가 다르기 때문에 정맥 신경총이 규칙적이지 않기 때문에 설명 된 방법은 쥐의 안정적이고 편안한 자세를 유지하면서 정맥 신경총의 위치를 쉽게 국소화 할 수 있습니다. (2) 수술이 쉽고 기술자의 기술이 빠르게 발전하고 동물에게 고통이 적습니다. (3) 동물을 편안하게 해주는 작동 모드…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 광동성 약물 비임상 평가 및 연구 핵심 연구소(No.2018B030323024)와 광둥성 핵심 연구 개발 계획의 핵심 프로그램 “신약 창출”(No.2019B02020202001), 광저우 기초 및 응용 재단 연구 프로젝트(No.202002030249 및 No.202002030156)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referencias
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