Muestreo repetitivo de sangre de la vena subclavia de rata consciente
Summary
El presente protocolo describe un método simple y eficiente para recolectar sangre de la vena subclavia en ratas. Permite un muestreo rápido, oportuno y fácilmente identificable sin anestesia y obtiene sangre de alta calidad a través de la recolección repetitiva de muestras.
Abstract
Las ratas se utilizan ampliamente en estudios farmacocinéticos (PK) y toxicocinéticos (TK) que necesitan recolectar una cierta cantidad de sangre en puntos de tiempo específicos para detectar la exposición al medicamento. El método de muestreo de sangre de rata determina la calidad del plasma y afecta aún más la precisión de los resultados de la prueba. El método de recolección de sangre de la vena subclavia descrito en este protocolo recoge muestras de sangre repetidamente en el estado consciente de los animales para satisfacer las necesidades de las pruebas farmacocinéticas y tradicionales. Las habilidades de manejo de la restricción y el procedimiento apropiado de incisión con aguja aseguran la tasa de éxito de la recolección de sangre. Es fácil de operar al tiempo que garantiza la calidad del plasma y, al mismo tiempo, atiende al bienestar animal. Sin embargo, este método requiere una operación experta, y una inadecuada puede causar debilidad animal, dolor, cojera e incluso mortalidad. El método actual se ha utilizado en el centro de pruebas para un estudio de toxicidad oral de 4 semanas en ratas Sprague Dawley (SD) con CC.TT. La cantidad máxima de sangre recolectada dentro de las 24 h no excedió el 20% de la sangre total del animal. El peso corporal de los animales era de más de 200 g para machos y hembras. Los datos mostraron que el peso corporal de los animales aumentó constantemente cada semana, y la observación clínica fue normal después de la recolección repetitiva de muestras.
Introduction
De acuerdo con las directrices 1 de la Conferencia Internacional sobre la Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) ylas directrices 2 de la Administración Nacional de Productos Médicos (NMPA), el número de puntos de tiempo de extracción de sangre de ratas en el estudio toxicocinético (CC.TT.) debe cumplir los requisitos de la evaluación dinámica de la exposición al fármaco. El volumen sanguíneo total aproximado de una rata es de 55-70 mL/kg de peso corporal3. Los puntos de tiempo de recolección son generalmente intensivos dentro de los 30 minutos después de la dosificación y disminuyen después de eso, y se deben recolectar más de diez muestras de sangre dentro de las 48 h en las pruebas de rutina4. Por ejemplo, las muestras de sangre se recogen en 12 puntos de tiempo (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h y 12 h) en el estudio de conocimientos tradicionales de fármacos administrados por vía oral. Los investigadores deben recolectar repetidamente 200-250 μL de sangre en ratas para obtener plasma de alta calidad para la prueba de conocimientos tradicionales5.
Los sitios de recolección de sangre en ratas incluyen vasos sanguíneos de la cola, vena del plexo retroorbital, vena submandibular, corazón, aorta abdominal6, etc. Entre ellos, la recolección de sangre de la vena caudal de ratas es un método de uso frecuente, que requiere operadores experimentados y capacitados 7,8. Recolectar sangre de la vena del plexo retroorbitario es menos complicado; Sin embargo, este método no se recomienda ya que puede dañar la vista de las ratas9, y la sangre del corazón y la aorta abdominal sólo es apropiada para el muestreo final de sangre10. Otro método de recolección de sangre de la vena submandibular en una rata consciente ha demostrado resultar en más complicaciones y reveló una calidad insuficiente de la muestra de sangre11. Por lo tanto, los investigadores pueden anestesiar al animal para reducir la dificultad del muestreo. Aún así, la anestesia también aumenta el costo del experimento y, lo que es más grave, afectará el estado metabólico de las ratas12. El presente protocolo utiliza un método rápido y sencillo de recolección de sangre en las venas subclavias de ratas sin anestesia, lo que permite un posicionamiento preciso y una recolección de sangre alterna bilateral para obtener muestras de alta calidad de manera oportuna y repetida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay ciertos beneficios de recolectar sangre de las venas subclavias. (1) Como el sitio de la recolección de sangre se disocia fácilmente, y el plexo venoso no es regular debido a las diferentes posturas de las ratas, el método descrito puede localizar fácilmente la posición del plexo venoso mientras mantiene las posturas estables y cómodas de las ratas. (2) La operación es fácil y favorable para el rápido desarrollo de las habilidades de los técnicos y menos dolor para los animales. (3) Un modo de funcionamient…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el Laboratorio Provincial Clave de Evaluación e Investigación No Clínica de Medicamentos de Guangdong (No.2018B030323024) y el Programa Clave “Creación de Nuevos Medicamentos” del Plan de Investigación y Desarrollo Clave de Guangdong (No.2019B020202001), Proyecto de Investigación de la Fundación Fundamental y de Aplicación de Guangzhou (No.202002030249 y No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referencias
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