Amostragem Repetitiva de Sangue da Veia Subclávia de Rato Consciente
Summary
O presente protocolo descreve um método simples e eficiente de coleta de sangue da veia subclávia em ratos. Permite uma amostragem rápida, oportuna e facilmente identificável sem anestesia e obtém sangue de alta qualidade através da coleta repetitiva de amostras.
Abstract
Os ratos são amplamente utilizados em estudos de farmacocinética (PK) e toxicocinéticos (TK) que precisam coletar uma certa quantidade de sangue em pontos de tempo específicos para detectar a exposição a medicamentos. O método de amostragem de sangue de rato determina a qualidade do plasma e afeta ainda mais a precisão dos resultados dos testes. O método de coleta de sangue da veia subclávia descrito neste protocolo coleta amostras de sangue repetidamente no estado consciente dos animais para atender às necessidades dos testes PK e TK. As habilidades de manuseio de contenção e procedimento apropriado de incisão com agulha garantem a taxa de sucesso da coleta de sangue. É fácil de operar, garantindo a qualidade do plasma e, ao mesmo tempo, atendendo ao bem-estar animal. No entanto, este método requer operação qualificada, e um inadequado pode causar fraqueza animal, dor, claudicação e até mortalidade. O método atual foi utilizado na instalação de teste para um estudo de toxicidade oral de 4 semanas em ratos Sprague Dawley (SD) com TK. A quantidade máxima de sangue coletada em 24 h não excedeu 20% do sangue total do animal. O peso corporal dos animais foi superior a 200 g para machos e fêmeas. Os dados mostraram que o peso corporal dos animais aumentou de forma constante a cada semana, e a observação clínica foi normal após a coleta repetitiva de amostras.
Introduction
De acordo com as diretrizes1 da Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) e as diretrizes2 da Administração Nacional de Produtos Médicos (NMPA), o número de pontos de tempo de coleta de sangue de ratos no estudo toxicocinético (TK) precisa atender aos requisitos da avaliação dinâmica da exposição a medicamentos. O volume sanguíneo total aproximado de um rato é de 55-70 mL/kg de peso corporal3. Os pontos de coleta são geralmente intensivos dentro de 30 minutos após a dosagem e diminuem depois disso, e mais de dez amostras de sangue precisam ser coletadas dentro de 48 h em testes de rotina4. Por exemplo, amostras de sangue são coletadas em 12 pontos de tempo (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h e 12 h) no estudo TK de medicamentos administrados por via oral. Os pesquisadores devem coletar repetidamente 200-250 μL de sangue em ratos para obter plasma de alta qualidade para o teste TK5.
Os locais de coleta de sangue em ratos incluem vasos sanguíneos da cauda, veia do plexo retro-orbital, veia submandibular, coração, aorta abdominal6 e assim por diante. Dentre eles, a coleta de sangue da veia caudal de ratos é um método frequentemente utilizado, que requer operadores experientes e qualificados 7,8. Coletar sangue da veia do plexo retroorbital é menos complicado; no entanto, esse método não é recomendado, pois pode danificar a visão dos ratos9, e o sangue do coração e da aorta abdominal só é apropriado para a coleta final de sangue10. Outro método de coleta de sangue da veia submandibular em um rato consciente demonstrou resultar em mais complicações e revelou qualidade insuficiente da amostra de sangue11. Portanto, os pesquisadores podem anestesiar o animal para reduzir a dificuldade de amostragem. Ainda assim, a anestesia também aumenta o custo do experimento e, mais seriamente, afetará o estado metabólico dos ratos12. O presente protocolo utiliza um método rápido e direto de coleta de sangue nas veias subclávias de ratos sem anestesia, permitindo posicionamento preciso e coleta de sangue bilateral alternada para obter amostras de alta qualidade de forma oportuna e repetida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem certos benefícios da coleta de sangue das veias subclávias. (1) Como o local da coleta de sangue é prontamente dissociado, e o plexo venoso não é regular devido às diferentes posturas dos ratos, o método descrito pode facilmente localizar a posição do plexo venoso, mantendo as posturas estáveis e confortáveis dos ratos. (2) A operação é fácil e favorável ao rápido desenvolvimento das habilidades dos técnicos e menos dor aos animais. (3) Um modo de operação para deixar o animal confortável red…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Laboratório Chave Provincial de Guangdong de Avaliação e Pesquisa Não Clínica de Medicamentos (No.2018B030323024) e pelo Programa Chave “Criação de Novos Medicamentos” do Plano de Pesquisa e Desenvolvimento Chave de Guangdong (No.2019B020202001), Projeto de Pesquisa da Fundação Fundamental e de Aplicação de Guangzhou (No.202002030249 e No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referencias
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
