Campionamento ripetitivo di sangue dalla vena succlavia del ratto cosciente
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per raccogliere il sangue dalla vena succlavia nei ratti. Consente un campionamento rapido, tempestivo e facilmente identificabile senza anestesia e ottiene sangue di alta qualità attraverso la raccolta ripetitiva dei campioni.
Abstract
I ratti sono ampiamente utilizzati negli studi di farmacocinetica (PK) e tossicocinetica (TK) che devono raccogliere una certa quantità di sangue in punti temporali specifici per rilevare l’esposizione al farmaco. Il metodo di prelievo del sangue di ratto determina la qualità del plasma e influisce ulteriormente sulla precisione dei risultati del test. Il metodo di raccolta del sangue della vena succlavia descritto in questo protocollo raccoglie ripetutamente campioni di sangue nello stato di coscienza degli animali per soddisfare le esigenze dei test PK e TK. Le abilità di gestione della contenzione e la procedura appropriata di incisione dell’ago assicurano il tasso di successo della raccolta del sangue. È facile da usare, garantendo allo stesso tempo la qualità del plasma e allo stesso tempo il benessere degli animali. Tuttavia, questo metodo richiede un’operazione esperta e uno improprio può causare debolezza, dolore, zoppia e persino mortalità degli animali. L’attuale metodo è stato utilizzato nella struttura di test per uno studio di tossicità orale di 4 settimane in ratti Sprague Dawley (SD) con TK. La quantità massima di sangue raccolta entro 24 ore non ha superato il 20% del sangue totale dell’animale. Il peso corporeo degli animali era superiore a 200 g per maschi e femmine. I dati hanno mostrato che il peso corporeo degli animali aumentava costantemente ogni settimana e l’osservazione clinica era normale dopo la raccolta ripetitiva dei campioni.
Introduction
Secondo le linee guida 1 della Conferenza internazionale sull’armonizzazione dei requisiti tecnici per la registrazione dei prodotti farmaceutici per uso umano (ICH)e le linee guida 2 della National Medical Products Administration (NMPA), il numero di punti temporali di raccolta del sangue dei ratti nello studio tossicocinetico (TK) deve soddisfare i requisiti della valutazione dinamica dell’esposizione ai farmaci. Il volume totale approssimativo del sangue di un ratto è 55-70 ml / kg di peso corporeo3. I punti temporali di raccolta sono generalmente intensi entro 30 minuti dopo la somministrazione e diminuiscono dopo, e più di dieci campioni di sangue devono essere raccolti entro 48 ore nei test di routine4. Ad esempio, i campioni di sangue vengono raccolti in 12 punti temporali (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h e 12 h) nello studio TK di farmaci somministrati per via orale. I ricercatori devono raccogliere ripetutamente 200-250 μL di sangue nei ratti per ottenere plasma di alta qualità per il test TK5.
I siti di raccolta del sangue nei ratti includono vasi sanguigni della coda, vena del plesso retro-orbitale, vena sottomandibolare, cuore, aorta addominale6 e così via. Tra questi, la raccolta del sangue dalla vena caudale dei ratti è un metodo frequentemente usato, che richiede operatori esperti e qualificati 7,8. Raccogliere il sangue dalla vena del plesso retro-orbitale è meno complicato; Tuttavia, questo metodo non è raccomandato in quanto può danneggiare la vista dei ratti9 e il sangue dal cuore e dall’aorta addominale è appropriato solo per il prelievo di sangue finale10. Un altro metodo di raccolta del sangue dalla vena sottomandibolare in un ratto cosciente ha dimostrato di provocare più complicazioni e ha rivelato una qualità del campione di sangue insufficiente11. Pertanto, i ricercatori possono anestetizzare l’animale per ridurre la difficoltà di campionamento. Tuttavia, l’anestesia aumenta anche il costo dell’esperimento e, cosa più grave, influenzerà lo stato metabolico dei ratti12. Il presente protocollo utilizza un metodo rapido e semplice di raccolta del sangue nelle vene succlavia dei ratti senza anestesia, consentendo un posizionamento accurato e una raccolta bilaterale alternata del sangue per ottenere campioni di alta qualità in modo tempestivo e ripetuto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono alcuni benefici della raccolta di sangue dalle vene succlavia. (1) Poiché il sito della raccolta del sangue è facilmente dissociato e il plesso venoso non è regolare a causa delle diverse posture dei ratti, il metodo descritto può facilmente localizzare la posizione del plesso venoso mantenendo le posture stabili e confortevoli dei ratti. (2) L’operazione è facile e favorevole al rapido sviluppo delle capacità dei tecnici e meno dolore per gli animali. (3) Una modalità operativa per rendere l’animale confo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) e dal Key Program “New Drug Creation” del Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 e No.202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
Referencias
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