Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis</em

Summary

Een gedetailleerd protocol is beschreven voor de beeldvorming van de real-time vorming van DNA-herstel complexen in<em> Bacillus subtilis</em> Cellen.

Abstract

Zowel de prokaryoten en eukaryoten te reageren op DNA-schade door een complex geheel van lichamelijke veranderingen. Veranderingen in genexpressie, de herverdeling van bestaande eiwitten, en de assemblage van nieuwe eiwit-complexen kan worden gestimuleerd door een verscheidenheid van DNA-laesies en verkeerde DNA basenparen. Fluorescentie microscopie is gebruikt als een krachtig experimenteel hulpmiddel voor het visualiseren en te kwantificeren deze en andere reacties op DNA laesies en DNA-replicatie-status te controleren binnen het complex subcellulaire architectuur van een levende cel. Translationele fusies tussen fluorescerende reporter eiwitten en componenten van de DNA-replicatie en reparatie machines zijn gebruikt om de signalen te bepalen die zich richten op DNA-reparatie eiwitten aan hun verwante letsels<em> In vivo</em> En om te begrijpen hoe deze eiwitten worden georganiseerd in bacteriële cellen. Daarnaast zijn transcriptionele en translationele fusies gekoppeld aan DNA-schade induceerbare promoters geopenbaard die cellen binnen een populatie hebben genotoxische stress respons geactiveerd. In deze review, bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van fluorescentiemicroscopie het imago van de assemblage van DNA-reparatie en DNA-replicatie complexen in enkele bacteriële cellen. In het bijzonder dit werk richt zich op beeldvorming mismatch repair eiwitten, homologe recombinatie, DNA-replicatie en een SOS-induceerbare eiwit in<em> Bacillus subtilis</em>. Alle hier beschreven procedures zijn gemakkelijk vatbaar voor beeldvorming eiwitcomplexen in een verscheidenheid van bacteriële soorten.

Protocol

Groeiende culturen van cellen voor microscopie 1. Een of twee dagen voor de beeldvorming, de voorbereiding van de B. subtilis stam die het translationele fusie-eiwit u wenst te visualiseren. Trial rondes van de stappen 1A en 1B zal nodig zijn om te bepalen welke groei de conditie van de beste beelden van je stam biedt. In de meeste gevallen, moeten cellen worden afgebeeld tijdens de exponentiële groei fase. Voor sommige B. subtilis stammen (in het…

Discussion

Trial and error zijn verplicht om de blootstelling voorwaarden te vinden voor de hoogste kwaliteit beelden voor elke stam, vinden we dat een milliseconde is geschikt voor wit licht beelden, terwijl de blootstelling van 100 tot 2000 ms zijn geschikt voor GFP (FITC) en FM4-64 (TRITC ) beelden. Belichtingstijd is afhankelijk van de gebruikte beeldvormende apparatuur. Wij raden het gebruik van een stam per 15-well microscoop glijbaan voor de eenvoudigste beeldvorming, als pad de kwaliteit en de verspreiding van cellen van h…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize