Подробный протокол описан для визуализации реального времени формирования комплексов репарации ДНК в<em> Сенная Bacillus</em> Клеток.
Оба прокариоты и эукариоты ответ на повреждение ДНК через сложный набор физиологических изменений. Изменения в экспрессии генов, перераспределения существующих белков и сборку новых белковых комплексов можно стимулировать с помощью различных повреждений ДНК и несовпадающих пар оснований ДНК. Люминесцентной микроскопии был использован в качестве мощного экспериментального инструмент для визуализации и количественной оценки этих и других ответов на повреждения ДНК и контролировать состояние репликации ДНК в комплексе архитектуры субклеточных живой клетке. Поступательное слияния между флуоресцентных белков репортер и компоненты репликации ДНК и ремонт техники были использованы для определения сигналов, предназначенных для восстановления ДНК белков на их родственные поражения<em> В естественных условиях</em> И понять, как эти белки организованы в бактериальных клетках. Кроме того, транскрипции и трансляции слияния связаны с ДНК промоутеров повреждения индуцибельной показали, какие клетки в популяции активировали генотоксического ответы стресса. В этом обзоре мы предлагаем подробный протокол для использования флуоресцентной микроскопии для изображения сборки репарации ДНК и репликации ДНК комплексов в одной бактериальной клетки. В частности, эта работа направлена на несоответствие изображения ремонт белков, гомологичной рекомбинации, репликации ДНК и SOS-индуцируемого белка в<em> Сенная Bacillus</em>. Все процедуры, описанные здесь, легко поддается для работы с изображениями белковых комплексов в различных видов бактерий.
Методом проб и ошибок требуется найти воздействия условий для высокого качества изображения для каждого штамма, мы находим, что 1 миллисекунду подходит для белых изображений света, в то время как воздействие от 100 до 2000 мс подходят для GFP (FITC) и FM4-64 (TRITC ) изображения. Экспозиция будет меня?…
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Philina С. Ли и Алан Д. Гроссман для Первоначально обучение ЛАГ в флуоресцентной микроскопии. Авторы также благодарят доктора. Мелани Беркмен и Hajime Кобаяси за помощь и советы для работы с изображениями. Эта работа была поддержана запуска средства из Колледжа литературы, науки и искусства и от Департамента молекулярном, клеточном и биологии развития в Университете штата Мичиган.
Specific solution recipes1:
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize