Imaging mismatch repair e risposte cellulari al danno del DNA in Bacillus subtilis</em

Summary

Un protocollo dettagliato è descritto per l'imaging in tempo reale la formazione di complessi di riparazione del DNA in<em> Bacillus subtilis</em> Cellule.

Abstract

Sia procarioti ed eucarioti rispondere a danni al DNA attraverso una complessa serie di cambiamenti fisiologici. Alterazioni nell'espressione genica, la redistribuzione delle proteine ​​esistenti e l'assemblaggio di complessi proteici nuovo può essere stimolata da una varietà di lesioni del DNA e non corrispondenti coppie di basi del DNA. Microscopia a fluorescenza è stato utilizzato come un potente strumento sperimentale per visualizzare e quantificare le risposte a queste ed altre lesioni del DNA e per monitorare lo stato replicazione del DNA all'interno della complessa architettura subcellulare di una cellula vivente. Fusioni traduzionali tra proteine ​​fluorescenti giornalista e componenti della replicazione del DNA e riparazione macchinari sono stati utilizzati per determinare i segnali che l'obiettivo del DNA proteine ​​di riparazione delle lesioni ai loro affini<em> In vivo</em> E per capire come queste proteine ​​sono organizzati all'interno delle cellule batteriche. Inoltre, fusioni trascrizionale e traslazionale legata ai promotori inducibili danni al DNA hanno rivelato che le cellule all'interno di una popolazione hanno attivato le risposte allo stress genotossico. In questa recensione, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di microscopia a fluorescenza per l'immagine del montaggio di riparazione del DNA e complessi di replicazione del DNA in singole cellule batteriche. In particolare, questo lavoro si concentra sulle proteine ​​mancata corrispondenza riparazione di imaging, ricombinazione omologa, replicazione del DNA e un SOS-inducibile proteina<em> Bacillus subtilis</em>. Tutte le procedure descritte qui sono facilmente suscettibili di complessi proteici di imaging in una varietà di specie batteriche.

Protocol

Colture di cellule in crescita per microscopia 1. Uno o due giorni prima di imaging, preparare la B. subtilis ceppo contenente la proteina di fusione traslazionale che si desidera visualizzare. Turni di prova di 1A e 1B passi saranno necessari per determinare quale condizione di crescita fornisce le migliori immagini del vostro sforzo. Nella maggior parte dei casi, le cellule dovrebbero essere esposte durante la fase di crescita esponenziale. Per alcune <em…

Discussion

Tentativi ed errori sono necessari per trovare condizioni di esposizione per immagini di altissima qualità per ogni ceppo, troviamo che 1 millisecondo è appropriato per le immagini a luce bianca, mentre l'esposizione da 100 a 2000 ms sono appropriati per GFP (FITC) e FM4-64 (TRITC ) le immagini. Tempo di esposizione variano a seconda delle apparecchiature di imaging utilizzate. Si consiglia l'uso di un ceppo per 15 pozzetti vetrino da microscopio per il più semplice di imaging, come la qualità pad e la diffu…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize