Mismatch repair imagerie et les réponses cellulaires aux dommages de l'ADN dans</em

Summary

Un protocole détaillé est décrit pour l'imagerie en temps réel la formation de complexes de réparation de l'ADN<emBacillus subtilis></em> Cellules.

Abstract

Les deux procaryotes et les eucaryotes répondent aux dommages à l'ADN à travers un ensemble complexe de changements physiologiques. Altérations de l'expression génique, la redistribution des protéines existantes, et l'assemblage des complexes protéiques nouvelle peut être stimulée par une variété de lésions de l'ADN et dépareillés paires de bases d'ADN. La microscopie à fluorescence a été utilisé comme un puissant outil expérimental pour la visualisation et la quantification de ces réponses et autres lésions de l'ADN et à surveiller l'état de réplication de l'ADN au sein de l'architecture complexe subcellulaire d'une cellule vivante. Fusions traductionnelles entre les protéines rapporteur fluorescent et des composants de la réplication de l'ADN et les machines de réparation ont été utilisés pour déterminer les indices que les protéines cibles réparation de l'ADN de leurs lésions apparentées<em> In vivo</em> Et de comprendre comment ces protéines sont organisées dans les cellules bactériennes. En outre, les fusions transcriptionnelles et translationnelle liée à des promoteurs inductibles endommager l'ADN ont révélé que les cellules au sein d'une population ont activé les réponses au stress génotoxique. Dans cette revue, nous proposons un protocole détaillé pour l'utilisation de la microscopie par fluorescence à l'image de l'assemblage de réparation de l'ADN et des complexes de réplication de l'ADN dans des cellules bactériennes simples. En particulier, ce travail se concentre sur les protéines de réparation des mésappariements d'imagerie, la recombinaison homologue, la réplication de l'ADN et une protéine de SOS-inductible dans<emBacillus subtilis></em>. Toutes les procédures décrites ici sont facilement prête pour les complexes protéiques d'imagerie dans une variété d'espèces de bactéries.

Protocol

Cultures en croissance de cellules pour la microscopie 1. Un ou deux jours avant l'imagerie, de préparer le B. subtilis souche contenant la protéine de fusion traductionnelle vous souhaitez visualiser. Tours de première instance de 1A et 1B étapes seront nécessaires pour déterminer quelle condition la croissance fournit les meilleures images de vos contraintes. Dans la plupart des cas, les cellules doivent être imagés pendant la phase de croissance exponentielle. <ol c…

Discussion

Essais et erreurs sont nécessaires pour trouver des conditions d'exposition pour des images de haute qualité pour chaque souche; nous trouvons que 1 milliseconde est approprié pour des images en lumière blanche, tandis que des expositions de 100 à 2000 ms sont appropriés pour la GFP (FITC) et FM4-64 (TRITC ) des images. Le temps d'exposition varie en fonction de l'équipement d'imagerie utilisée. Nous recommandons l'utilisation d'une souche par lame de microscope 15 puits pour les plus sim…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize