原核生物と真核生物の両方の生理的変化の複雑なセットを介してDNA損傷に応答する。遺伝子発現、既存の蛋白質の再分配、及び新たなタンパク質複合体のアセンブリの変化は、DNAの損傷とミスマッチDNAの塩基対の種々の方法によって刺激することができる。蛍光顕微鏡は、DNA損傷にと生きている細胞の複雑な細胞内のアーキテクチャの中でDNAの複製の状態を監視するために、これらおよび他の応答を可視化し定量化するための強力な実験ツールとして用いられている。蛍光レポータータンパク質とDNA複製と修復機構のコンポーネント間の翻訳融合は、手がかりを決定するために使用されているその同族病変の標的DNA修復タンパク質<em> in vivoで</em>そしてこれらのタンパク質が細菌細胞内で編成されているかを理解する。さらに、DNA損傷誘導性プロモーターに連結された転写と翻訳融合は、集団内の細胞は遺伝毒性ストレス応答を活性化されているいるを明らかにした。このレビューでは、我々は、画像にDNAの修復と、単一の細菌細胞のDNA複製複合体のアセンブリを蛍光顕微鏡を使用するための詳細なプロトコルを提供しています。特に、この作品は、イメージングのミスマッチ修復タンパク質、相同組換え、DNA複製とSOS誘導性蛋白質の焦点を当て<em>枯草菌</em>。ここで説明する手順のすべては、細菌種の様々なイメージングのタンパク質複合体に対して容易に適している。
10x S750 salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage
100x Metals
0.2 M MgCl2
70 mM CaCl2
5 mM MnCl2
0.1 mM ZnCl2
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl3*
dH2O to final volume
*FeCl3 should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.
S750 media
1x S750 salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H2O to final volume
10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO4 (2g/L)
dH2O to final volume
Filter sterilize
Klocko, A. D., Crafton, K. M., Walsh, B. W., Lenhart, J. S., Simmons, L. A. Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (36), e1736, doi:10.3791/1736 (2010).