Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Summary

Ein detailliertes Protokoll ist für die Darstellung der Echtzeit Bildung von DNA-Reparatur-Komplexe beschrieben<em> Bacillus subtilis</em> Zellen.

Abstract

Prokaryoten und Eukaryoten zu DNA-Schäden reagieren, durch eine komplexe Reihe von physiologischen Veränderungen. Veränderungen der Genexpression, die Umverteilung der vorhandenen Proteine ​​und die Montage neuer Protein-Komplexe können durch eine Vielzahl von DNA-Schäden und nicht übereinstimmende DNA-Basenpaare stimuliert werden. Fluoreszenzmikroskopie ist als leistungsfähiges experimentelles Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von diesen und anderen Reaktionen auf DNA-Schäden und DNA-Replikation Status innerhalb der komplexen subzellulären Architektur einer lebenden Zelle zu überwachen verwendet worden. Translational Fusionen zwischen fluoreszierenden Reporter-Proteinen und Komponenten der DNA-Replikation und Reparatur Maschinen wurden verwendet, um die Signale zu bestimmen, die auf DNA-Reparatur-Proteine ​​an ihre spezifischen Läsionen<em> In vivo</em> Und zu verstehen, wie diese Proteine ​​in bakteriellen Zellen organisiert sind. Darüber hinaus haben der Transkription und Translation Fusionen im Zusammenhang mit DNA-Schäden Promotoren zeigten die Zellen innerhalb einer Population haben genotoxischen Stress-Reaktionen aktiviert. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie zur Abbildung der Montage der DNA-Reparatur und DNA-Replikation Komplexe in einzelnen Bakterienzellen. Insbesondere konzentriert sich diese Arbeit auf die Bildgebung Mismatch-Reparatur-Proteine, die homologe Rekombination, DNA-Replikation und eine SOS-induzierbare Protein in<em> Bacillus subtilis</em>. Alle hier beschriebenen Verfahren leicht zugänglich sind für die Bildgebung Protein-Komplexe in einer Vielzahl von Bakterienarten.

Protocol

Wachsende Kulturen von Zellen für die Mikroskopie 1. Ein oder zwei Tage vor der Bildgebung, bereiten die B. subtilis Stamm, der translationalen Fusionsprotein Sie zu visualisieren. Testversion Runden Schritte 1A und 1B wird notwendig sein, um festzustellen, welche das Wachstum Zustand die besten Bilder Ihres Stammes zur Verfügung stellt. In den meisten Fällen sollten die Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase abgebildet werden. Für einige <em…

Discussion

Versuch und Irrtum sind erforderlich, um die Exposition Bedingungen für die Bilder von höchster Qualität für jeden Stamm zu finden, finden wir, dass 1 Millisekunde geeignet für weißes Licht Bilder, während die Exposition von 100 bis 2000 ms für GFP (FITC) und FM4-64 geeignet sind (TRITC ) Bilder. Belichtungszeit hängt von der Imaging-Geräte verwendet. Wir empfehlen die Verwendung eines Stammes pro 15-well Objektträger für die einfachsten Bildgebung, wie pad Qualität und Verbreitung von Zellen aus dem Pad Gr…

Materials

Specific solution recipes¹:

10x S7₅₀ salts
0.5 M MOPS
100 mM Ammonium Sulfate
50 mM Potassium Phosphate Monobasic
Filter sterilize, and wrap S7₅₀ media in foil prior to storage

100x Metals
0.2 M MgCl₂
70 mM CaCl₂
5 mM MnCl₂
0.1 mM ZnCl₂
100 μg/mL Thiamine HCl
2 mM HCl
0.5 mM FeCl₃*
dH₂O to final volume
*FeCl₃ should be added last, to prevent precipitation.
After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil.

S7₅₀ media
1x S7₅₀ salts
1x Metal
1% Glucose
0.1% Glutamate
40 μg/mL Tryptophan
40 μg/mL Phenylalanine
distilled H₂O to final volume

10x Spizizens (grams/L)
151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L)
803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L)
440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L)
34.0 mM Sodium Citrate (10g/L)
16.6 mM MgSO₄ (2g/L)
dH₂O to final volume
Filter sterilize