Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Epitelcellsinfektionsanalyser med Shigella

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Det nuvarande protokollet beskriver infektionsanalyser för att undersöka Shigella-vidhäftning , invasion och intracellulär replikation med hjälp av in vitro-epitelcellinjer .

Abstract

Den människoanpassade enteriska bakteriepatogenen Shigella orsakar miljontals infektioner varje år, skapar långsiktiga tillväxteffekter bland pediatriska patienter och är en ledande orsak till diarrédödsfall över hela världen. Infektion inducerar vattnig eller blodig diarré som ett resultat av att patogenen passerar mag-tarmkanalen och infekterar epitelcellerna som kantar tjocktarmen. Med en häpnadsväckande ökning av antibiotikaresistens och den nuvarande bristen på godkända vacciner är standardiserade forskningsprotokoll avgörande för att studera denna formidabla patogen. Här presenteras metoder för att undersöka den molekylära patogenesen av Shigella med hjälp av in vitro-analyser av bakteriell vidhäftning, invasion och intracellulär replikation i kolonepitelceller. Före infektionsanalyserna verifierades virulensfenotypen hos Shigella-kolonier genom upptag av det kongolesiska röda färgämnet på agarplattor. Kompletterade laboratoriemedier kan också övervägas under bakterieodling för att efterlikna in vivo-förhållanden . Bakterieceller används sedan i ett standardiserat protokoll för att infektera tjocktarmsepitelceller i vävnadsodlingsplattor vid en etablerad multiplicitet av infektion med anpassningar för att analysera varje steg av infektionen. För adherensanalyser inkuberas Shigella-celler med reducerade medienivåer för att främja bakteriell kontakt med epitelceller. För både invasions- och intracellulära replikationsanalyser används gentamicin för olika tidsintervall för att eliminera extracellulära bakterier och möjliggöra bedömning av invasion och/eller kvantifiering av intracellulära replikationshastigheter. Alla infektionsprotokoll räknar upp vidhäftande, invaderade och/eller intracellulära bakterier genom att seriespäda infekterade epitelcellslysat och plätera bakteriekolonibildande enheter i förhållande till infekterande titrar på Kongoröda agarplattor. Tillsammans möjliggör dessa protokoll oberoende karakterisering och jämförelser för varje steg av Shigella-infektion av epitelceller för att studera denna patogen framgångsrikt.

Introduction

Diarrésjukdomar orsakade av bakteriella patogener i mag-tarmkanalen är en betydande global hälsobörda. År 2016 orsakade diarrésjukdomar 1,3 miljoner dödsfall i världen och var den fjärde vanligaste dödsorsaken hos barn yngre än fem år 1,2. Den gramnegativa, enteriska bakteriepatogenen Shigella är orsaken till shigellos, en viktig orsak till diarrédödsfall över hela världen3. Shigellos orsakar betydande sjuklighet och dödlighet varje år hos barn från låg- och medelinkomstländer 4,5, medan infektioner i höginkomstländer är kopplade till daghem, livsmedelsburna och vattenburna utbrott 6,7,8,9. Ineffektiv utveckling av vaccin10 och ökande antimikrobiell resistens11,12 har komplicerat hanteringen av storskaliga Shigella-utbrott. Nya data från Centers for Disease Control and Prevention visar att nästan 46 % av Shigella-infektionerna i USA uppvisade läkemedelsresistens 202013,14, medan Världshälsoorganisationen har förklarat Shigella som en AMR-prioriterad patogen för vilken det finns ett akut behov av nya terapier15.

Shigellainfektioner överförs lätt via fekal-oral väg vid intag av förorenad mat eller vatten, eller genom direkt mänsklig kontakt. Shigella har utvecklats till att bli en effektiv, mänskligt anpassad patogen, med en infektiös dos på 10-100 bakterier som är tillräcklig för att orsaka sjukdom16. Under tunntarmstransiteringen utsätts Shigella för miljösignaler, såsom förhöjd temperatur och galla17. Detektion av dessa signaler inducerar transkriptionsförändringar för att uttrycka virulensfaktorer som förbättrar bakteriernas förmåga att infektera den mänskliga tjocktarmen 17,18,19. Shigella invaderar inte kolonepitelet från den apikala ytan, utan passerar snarare över epitelskiktet efter upptag i specialiserade antigenpresenterande mikrovecksceller (M-celler) inom follikelassocierat epitel 20,21,22. Efter transcytos fagocytoseras Shigella-celler av residenta makrofager. Shigella flyr snabbt fagosomen och utlöser makrofagcelldöd, vilket resulterar i frisättning av proinflammatoriska cytokiner 5,23,24. Shigella invaderar sedan kolonepitelceller från den basolaterala sidan, lyserar den makropinocytiska vakuolen och etablerar en replikativ nisch i cytoplasman 5,25. Proinflammatoriska cytokiner, särskilt interleukin-8 (IL-8), rekryterar polymorfonukleära neutrofila leukocyter (PMN) till infektionsstället, vilket försvagar epitelns täta korsningar och möjliggör bakteriell infiltration av epitelslemhinnan för att förvärra basolateral infektion5. PMN:erna förstör den infekterade epitelslemhinnan för att begränsa infektionen, vilket resulterar i de karakteristiska symtomen på bacillär (blodig) dysenteri5. Även om invasions- och intracellulära replikationsmekanismer har karakteriserats grundligt, visar ny forskning viktiga nya koncept vid Shigella-infektion, inklusive virulensreglering under gastrointestinal (GI) transit17, följsamhet19, förbättrad basolateral åtkomst genom barriärpermeabilitet26 och asymtomatisk bärarskap hos undernärda barn27.

Förmågan hos Shigella spp. att orsaka diarrésjukdom är begränsad till människor och icke-mänskliga primater (NHP)28. Shigella tarminfektionsmodeller har utvecklats för zebrafiskar29, möss30, marsvin31, kaniner 21,32,33 och grisar34,35. Inget av dessa modellsystem kan dock exakt replikera de sjukdomsegenskaper som observerats under infektion hos människa36. Även om NHP-modeller av shigellos har etablerats för att studera Shigellas patogenes, är dessa modellsystem dyra att implementera och kräver artificiellt höga infektionsdoser, upp till nio storleksordningar högre än den infektiösa dosen för människor 37,38,39,40,41,42. Således kräver den anmärkningsvärda anpassningen av Shigella för infektion av mänskliga värdar användningen av mänskliga cellkulturer för att återskapa fysiologiskt relevanta modeller för korrekt undersökning av Shigella-patogenesen.

Här beskrivs detaljerade procedurer för att mäta graden av Shigella-vidhäftning till, invasion av och replikation inom HT-29 kolonepitelceller. Med hjälp av dessa standardiserade protokoll kan de molekylära mekanismerna genom vilka bakteriella virulensgener och miljösignaler påverkar varje steg av Shigella-infektion undersökas för att bättre förstå det dynamiska förhållandet mellan värd och patogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av reagenser och material

OBS: Alla volymer överensstämmer med en analys med två 6-brunnsplattor.

  1. TSB-medium: Tillsätt 0.5 L avjoniserat (DI) vatten till 15 g tryptisk sojabuljong (TSB, se materialtabell) medium och autoklav. Förvaras i rumstemperatur.
  2. Gallsalter medium (TSB + BS): För att bereda TSB som innehåller 0,4 % (vikt/volym) gallsalter, återsuspendera 0,06 g gallsalter (BS, se materialtabell) i 15 ml autoklaverad TSB. Sterilisera filtret med ett 0,22 μm PES-filter.
    OBS: Gallsalterna består av en 1:1 blandning av natriumkolat och natriumdeoxikolat. Förbered nytt material omedelbart före användning.
  3. DMEM + 10 % (v/v) FBS: Tillsätt 5 ml fetalt bovint serum (FBS) till 45 ml Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM). Förvaras vid 4 °C.
  4. DMEM + gentamicin: Tillsätt 50 ml DMEM och 50 μl gentamicin till ett 50 ml rör (se materialförteckning).
    OBS: Gör färsk alikvot och värm i ett 37 °C vattenbad före varje experiment.
  5. PBS + 1 % (v/v) Triton X-100: Tillsätt 150 μL Triton X-100 till 15 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
    OBS: Gör färsk alikvot och värm i ett 37 °C vattenbad före varje experiment.
  6. TSB + Kongoröda indikatorplattor: Tillsätt 15 g TSB, 7,5 g utvald agar och 0,125 g Kongorött färgämne (se Materialförteckning) i en 1 L flaska. Tillsätt 0,5 L DI-vatten och autoklav. Häll 10–20 ml media i enskilda sterila petriskålar (100 mm x 15 mm) och låt stelna.
    VARNING: Kongorött är cancerframkallande och ett reproduktionsgift. Se till att hanteringen av Kongorött sker med lämplig personlig skyddsutrustning. Se produktsäkerhetsdatabladet för ytterligare information.
    OBS: Cirka 20 plattor är gjorda av 0.5 L Kongorött media. Plattorna kan förberedas 2-3 dagar i förväg och lämnas upp och ner i rumstemperatur tills de används. För långtidsförvaring, placera de inverterade plattorna i plastfickor vid 4 °C i upp till 3 månader.
  7. DMEM + 10 % (v/v) FBS och 5 % (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO): Tillsätt 42,5 ml DMEM, 5 ml FBS och 2,5 ml DMSO till ett 50 ml rör. Förvaras vid 4 °C.

2. Beredning av bakterier

OBS: Alla Shigella laboratorieodlings- och lagringsprotokoll är anpassade från Payne, S. M.43.

VARNING: Shigella spp. är riskgrupp 2-patogener44. Utför allt laboratoriearbete i en BSL-2-miljö, med ytterligare säkerhetsåtgärder vidtagna för att begränsa oavsiktlig exponering på grund av den låga infektionsdosen av Shigella spp.

  1. Tillväxt av Shigella från frysta lager
    1. Överför en liten mängd fryst kultur från den kryogena injektionsflaskan till en TSB + Kongoröd agarplatta med hjälp av en steril applikator.
    2. Flamsterilisera en inokuleringsslinga och låt den svalna. Stryk inokulum fram och tillbaka över en kvadrant av plattan. Flamma öglan, låt den svalna och stryk sedan från den första kvadranten till plattans andra kvadrant. Upprepa för att stryka inokulet i plattans tredje och fjärde kvadrant.
      OBS: Alternativt kan du stryka inokulum med en ny steril applikator mellan varje kvadrant.
    3. Vänd plattan upp och ner och inkubera vid 37 °C över natten.
      OBS: Inkubation vid temperaturer ≥37 °C krävs för uttryck av Shigella-virulensfaktorer som är nödvändiga för observation av Kongo-röd-positiv (CR+) fenotyp45. Avirulentkolonier kommer att ha ett vitt utseende och kommer inte att vara invasiva.
    4. Förslut plattan med paraffinfilm och förvara den i kylskåp vid 4 °C.
      OBS: Bakteriekolonier kommer att förbli livskraftiga på agarplattor i 1-2 veckor.
  2. Tillväxt av Shigella över natten i flytande kultur
    1. Fördela 3 ml TSB-media i sterila 14 ml odlingsrör.
    2. Välj en enda, välisolerad röd (CR+) koloni med hjälp av en steril applikator och återsuspendera i flytande media.
    3. Inkubera kulturerna över natten (16-18 timmar) vid 37 °C med skakning vid 250 varv per minut (rpm).

3. Beredning av HT-29 eukaryota celler

OBS: Alla volymer överensstämmer med en analys med två 6-brunnsplattor. HT-29-cellinjer förvärvades från American Type Culture Collection (ATCC). HT-29 underhållsprotokoll är anpassade från ATCC:s rekommendationer46. Alla medier ska förvärmas i ett vattenbad vid 37 °C före användning. Alla HT-29 underhållsprotokoll bör utföras i ett biosäkerhetsskåp. Avstå från att producera bubblor när du blandar/arbetar med HT-29-celler i media för att undvika dramatiska förändringar i pH.

  1. Upptining av HT-29-celler från fryst buljong
    1. Tina injektionsflaskan med HT-29-celler i ett 37 °C vattenbad.
      OBS: Se till att locket håller sig helt ovanför vattnet för att undvika kontaminering. Upptining bör ta mindre än 2 minuter.
    2. Ta bort injektionsflaskan från vattnet omedelbart efter att grödan är helt tinad och dekontaminera med 70 % etanol. Se till att alla steg från denna punkt utförs med aseptisk teknik.
    3. Tillsätt allt innehåll i injektionsflaskan till ett 15 ml centrifugrör som innehåller 9 ml DMEM + 10 % FBS. Centrifugera vid 125 x g i 5 minuter i rumstemperatur.
    4. Dekantera supernatanten i en avfallsbehållare och återsuspendera pelleten i 10 ml varm DMEM + 10 % FBS. Överför återsuspenderade celler till en 75 cm2 vävnadskolv (T75) som innehåller 10 ml varmt DMEM + 10 % FBS (total volym 20 ml).
    5. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 % CO2 tills cellerna når 90 % sammanflöde (cirka 6-7 dagar).
      OBS: Confluency uppskattas genom visuell approximation.
  2. Sådd av HT-29-celler
    1. Förvärm 20 ml PBS och 50 ml DMEM + 10 % FBS i ett 37 °C vattenbad och förvärm 3 ml 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA till rumstemperatur.
    2. När HT-29-cellerna (från steg 3.1) når 90 % sammanflöde, dekantera HT-29-cellodlingsmediet från T75-kolven i en avfallsbehållare. Häll ~10 ml varm PBS i kolven och snurra försiktigt för att tvätta. Dekantera PBS i en avfallsbehållare. Tvätta med varm PBS igen och dekantera.
    3. Tillsätt 2-3 ml 0,25 % (w/v) trypsin-EDTA och virvla försiktigt över hela ytan. Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 i 4 min.
    4. Ta ut kolven ur inkubatorn och snurra försiktigt trypsin-EDTA så att alla celler lossnar från ytan.
    5. Tillsätt omedelbart 6 ml varm DMEM + 10 % FBS för att inaktivera trypsinet. Pipettera upp och ner för att blanda ordentligt.
    6. Överför allt innehåll till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera det med 500 x g i 5 minuter i rumstemperatur.
    7. Dekantera försiktigt supernatanten i en avfallsbehållare och återsuspendera pelleten i 6 ml varm DMEM + 10 % FBS.
    8. Omedelbart efter omblandningen överförs 10 μl suspenderade HT-29-celler från mitten av odlingen till ett 0,2 ml PCR-rör. Tillsätt 10 μL Trypan blue dye till PCR-röret och blanda.
    9. Tillsätt 10 μL HT-29-cell/trypanblå blandning till en engångs grevinnecellräknarkammarglas (se materialförteckning). Räkna upp antalet levande celler och beräkna cellviabiliteten.
      OBS: När du dokumenterar antalet celler i sample, läs numret under det "levande" cellantalet, inte det totala cellantalet. Alternativt kan cellräkning utföras manuellt med hjälp av en hemocytometer.
    10. Såd återsuspenderade HT-29-celler i en ny T75-kolv eller 6-hålsplatta.
      1. För T75-kolv:
        1. Pipett försiktigt för att blanda och överför sedan 2,5 x 106 celler till en ny T75-kolv enligt ekvationen nedan:
          Equation 1
        2. Tillsätt varm DMEM + 10 % FBS-media till en slutlig volym på 20 ml (slutlig koncentration på 1,25 x 105 celler/ml).
        3. Sprid cellerna jämnt över kolven genom att försiktigt gunga fram och tillbaka.
        4. Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 tills cellerna når 80 % sammanflöde.
          OBS: För optimal tillväxt, byt ut DMEM + 10 % FBS-media i T75-kolven var ~3:e dag. Häll upp mediet i en avfallsbehållare och tillsätt 10 ml varm PBS i kolven. Snurra runt PBS:en försiktigt och dekantera den i avfallsbehållaren. Tillsätt sedan 20 ml färskt, varmt DMEM + 10 % FBS till kolven och återgå till 37 °C, 5 % CO 2-inkubatorn.
      2. För 6-hålsplatta:
        1. Pipett försiktigt för att blanda och överför sedan 5,85 x 106 celler till ett nytt 50 ml koniskt rör enligt ekvationen nedan:
          Equation 2
        2. Tillsätt varm DMEM + 10 % FBS-media till en slutlig volym på 26 ml (slutlig koncentration på 2,25 x 105 celler/ml).
        3. Pipett försiktigt för att blanda och fördela sedan 2 ml (4.5 x 105 celler) i enskilda brunnar med 6-brunnars plattor.
        4. Sprid cellerna jämnt över brunnen genom att försiktigt gunga upp/ner och vänster/höger 2-3x.
        5. Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 tills cellerna når 80 % -95 % sammanflöde (cirka 3-4 dagar).
          OBS: 85 % sammanflöde rekommenderas för invasions- och intracellulär replikationsanalys, medan 90 %-95 % sammanflöde rekommenderas för följsamhetsanalyser. Cellerna bör nå ~85 % sammanflöde efter 48 timmars inkubation med en slutlig koncentration på cirka 1 x 106 celler/brunn. Justeringar av antalet sådda celler och inkubationstiden kan krävas.
  3. Tillverkning av frysta HT-29-lager
    1. Alikvot 1 ml DMEM + 10 % FBS + 5 % DMSO-media i enskilda kryogena injektionsflaskor.
    2. Tillsätt 1 x 106 HT-29-celler från steg 3.2.7 till varje injektionsflaska. Beräkna cellvolymen enligt formeln nedan:
      Equation 3
    3. Förvara HT-29-celler under lång tid under -130 °C i frys för flytande kväveånga.

4. Analys av följsamhet

OBS: Alla volymer överensstämmer med en analys med två 6-brunnsplattor.

  1. Subkultur över en natt Shigella-kulturer via 1:50 utspädning till färska medier.
    1. Vortex, tillsätt sedan 100 μL av varje nattkultur till 5 ml färsk TSB eller TSB + BS i ett odlingsrör av lämplig storlek.
      OBS: Begränsa odlingsvolymen till <20 % av odlingskolvens eller rörets volym för att säkerställa korrekt luftning.
    2. Inkubera vid 37 °C med skakning vid 250 varv per minut tills cellerna når en optisk densitet (OD600) på 0,7 (mitten av logaritmningsfasen av Shigella-tillväxten ). ca 2-2,5 h.
      OBS: Under subkulturen, alikvot 50 ml DMEM och en tillräcklig volym PBS för alla tvättsteg och placera i ett 37 °C vattenbad. Låt materialet nå 37 °C före användning.
  2. Överför 2 x 108 kolonibildande enheter (CFU) subodlade Shigella till individuella 2 ml mikrocentrifugrör.
    OBS: 2 x 108 CFU motsvarar cirka 1 ml bakterieceller vid en OD600 på 0,7. Använd OD600-avläsningar för att approximera CFU/ml enligt kalibreringen av varje enskild spektrofotometer.
  3. Tvätta varje Shigella-prov 2 gånger med PBS.
    1. Pelletsceller genom centrifugering vid 17 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten, tillsätt sedan 1 ml varm PBS och återsuspendera pelleten väl, pipettera försiktigt provet upp och ner tills blandningen är helt homogen (8-10x).
    2. Upprepa steg 4.3.1 1x extra tid.
    3. Pelletceller genom centrifugering vid 17 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och återsuspendera pelletsen i 2 ml varm DMEM.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av resuspenderade bakterier kommer att vara 1 x 108 CFU/ml.
  4. Virtex och tillsätt sedan 1 ml (1 x 108 CFU) resuspenderad Shigella till varje brunn i de beredda HT-29 kolonepitelmonolagren i 6-hålsplattor (från steg 3.2.10.2).
    OBS: Infektioner utförs normalt vid en infektionsmultiplicitet (MOI; förhållandet mellan bakterieceller och epitelceller) på 100. För att testa olika MOI:er, späd ut återsuspenderad Shigella i varmt DMEM till önskad koncentration och tillsätt sedan 1 ml utspädda bakterier till HT-29-monolager. Till exempel, för att testa en MOI på 10, späd bakterier 1:10 genom att tillsätta 150 μL 1 x 108 CFU/ml bakterier till 1,35 ml varm DMEM och applicera sedan 1 ml (1 x 107 CFU) på HT-29-celler.
  5. Inkubera 6-hålsplattorna vid 37 °C med 5 % CO2 i 3 timmar.
  6. Under inkubationen bestäms den bakteriella infektionstitern.
    1. Bered 10-faldiga seriespädningar av återsuspenderade Shigella-celler (från steg 4.3.3) till PBS.
    2. Platta 100 μl av spädningarna 1 x 10-5 och 1 x 10-6 på TSB + Kongo och inkubera över natten vid 37 °C.
      Anmärkning: Plätering av 100 μl från 1 x 10-5 och 1 x 10-6 utspädningar motsvarar en slutlig utspädningsfaktor på 1 x 10-6 respektive 1 x 10-7.
  7. Efter inkubationen tvättas monolagren 4-5 gånger med PBS.
    1. Aspirera media från varje brunn.
      OBS: När du aspirerar media från 6-brunnsplattor, styr spetsen på sugen längs undersidan av brunnarna och försök undvika kontakt med HT-29-cellerna.
    2. Tillsätt 1 ml varm PBS i varje brunn och tvätta försiktigt.
      OBS: För att försiktigt tvätta 6-brunnars monolager med PBS, flytta plattan upp och ner och från sida till sida på bänkskivan. Att tvätta tallrikar i en cirkulär rörelse och/eller ta bort plattan från bänkytan kan orsaka mekaniskt avlägsnande av celler från plast.
    3. Upprepa steg 4.7.1 och 4.7.2 ytterligare 4 gånger.
  8. Avlägsna PBS genom aspiration och lyse HT-29-celler genom att tillsätta 1 ml PBS + 1 % Triton X-100 till varje brunn.
  9. Inkubera 6-hålsplattor vid 37 °C i 5 min.
  10. Använd en cellskrapa eller en böjd pipettspets för att skrapa de lyserade cellerna från botten av brunnen och överför hela 1 ml till ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör.
  11. Bestäm antalet cellassocierade bakterier.
    1. Virvla varje rör (från steg 4.10) i minst 30 s för att ytterligare förskjuta Shigella från de lyserade eukaryota cellerna.
    2. Förbered 10-faldiga seriespädningar av lysat till PBS.
    3. Platta 100 μl av spädningarna 1 x 10-2, 1 x 10-3 och 1 x 10-4 på TSB + Kongo och inkubera över natten vid 37 °C.
      Anmärkning: Plätering av 100 μL från 1 x 10-2, 1 x 10-3 och 1 x 10-4 utspädningar motsvarar en slutlig utspädningsfaktor på 1 x 10-3, 1 x 10-4 respektive 1 x 10-5.

5. Analys av invasion

OBS: Alla volymer överensstämmer med en analys med två 6-brunnsplattor.

  1. Subkultur över en natt Shigella-kulturer via 1:50 utspädning till färska medier.
    1. Vortex, tillsätt sedan 100 μL av varje nattkultur till 5 ml färsk TSB eller TSB + BS i ett odlingsrör av lämplig storlek.
      OBS: Begränsa odlingsvolymen till <20 % av odlingskolvens eller rörets volym för att säkerställa korrekt luftning.
    2. Inkubera vid 37 °C med skakning vid 250 varv per minut tills cellerna når en OD600 på 0,7 (mitten av logaritmningsfasen av Shigella-tillväxten ). ca 2-2,5 h.
      OBS: Under subkulturen, alikvot 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamicin och en tillräcklig volym PBS för alla tvättsteg och placera i ett 37 °C vattenbad. Låt materialet nå 37 °C före användning.
  2. Överför 2 x 108 CFUs subodlade Shigella till individuella 2 ml mikrocentrifugrör.
    OBS: 2 x 108 CFU motsvarar cirka 1 ml bakterieceller vid en OD600 på 0,7. Använd OD600-avläsningar för att approximera CFU/ml enligt kalibreringen av varje enskild spektrofotometer.
  3. Tvätta Shigella-prover 1x med PBS.
    1. Pelletsceller genom centrifugering vid 17 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten, tillsätt sedan 1 ml varm PBS och återsuspendera pelleten väl, pipettera försiktigt provet upp och ner tills blandningen är helt homogen (8-10x).
    2. Upprepa steg 5.3.1. 1x extra tid.
    3. Pelletceller genom centrifugering vid 17 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och återsuspendera pelletsen i 2 ml varm DMEM.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av resuspenderade bakterier kommer att vara 1 x 108 CFU/ml.
  4. Virtex och tillsätt sedan 1 ml (1 x 108 CFU) återsuspenderad Shigella plus 1 ml DMEM till varje brunn av de beredda HT-29 kolonepitelmonolagren i 6-hålsplattor (från steg 3.2.10.2).
    OBS: Infektioner utförs normalt vid en infektionsmultiplicitet (MOI; förhållandet mellan bakterieceller och epitelceller) på 100. För att testa olika MOI, späd ut återsuspenderad Shigella i DMEM till önskad koncentration och tillsätt sedan 1 ml utspädda bakterier till HT-29-monolager. Till exempel, för att testa en MOI på 10, späd bakterier 1:10 genom att tillsätta 150 μL 1 x 108 CFU/ml bakterier till 1,35 ml DMEM, tillsätt sedan 1 ml (1 x 107 CFU) till HT-29-celler.
  5. För att främja bakteriell kontakt med HT-29-cellerna, centrifugera 6-hålsplattorna vid 2 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur eller 37 °C om temperaturinställningen kan justeras.
    OBS: Centrifugering främjar bakteriell kontakt med HT-29-cellerna, vilket kringgår behovet av vidhäftningsfaktorer och gör att bakterierna snabbt kan invadera cellerna.
  6. Inkubera 6-hålsplattor vid 37 °C med 5 % CO2 i 45 min.
  7. Under inkubationen bestäms den bakteriella infektionstitern.
    1. Bered 10-faldiga seriespädningar av återsuspenderade Shigella-celler (från steg 5.3.3) till PBS.
    2. Platta 100 μl av spädningarna 1 x 10-5 och 1 x 10-6 på TSB + Kongo och inkubera över natten vid 37 °C.
      Anmärkning: Plätering av 100 μl från 1 x 10-5 och 1 x 10-6 utspädningar motsvarar en slutlig utspädningsfaktor på 1 x 10-6 respektive 1 x 10-7.
  8. Tvätta infekterade HT-29-celler noggrant 3x med 1 ml PBS.
    1. Aspirera media från varje brunn.
      OBS: När du aspirerar media från 6-brunnsplattor, styr spetsen på sugen längs undersidan av brunnarna och försök undvika kontakt med HT-29-cellerna.
    2. Tillsätt 1 ml varm PBS i varje brunn och tvätta försiktigt.
      OBS: För att försiktigt tvätta 6-brunnars monolager med PBS, flytta plattan upp och ner och från sida till sida på bänkskivan. Att tvätta tallrikar i en cirkulär rörelse och/eller ta bort plattan från bänkytan kan orsaka mekaniskt avlägsnande av celler från plast.
    3. Upprepa steg 5.8.1 och 5.8.2 ytterligare 2 gånger.
  9. Avlägsna PBS genom aspiration, tillsätt sedan 2 ml varmt DMEM kompletterat med 50 μg/ml gentamicin till varje brunn och inkubera i 30 minuter vid 37 °C med 5 % CO2 %.
  10. Tvätta infekterade HT-29-celler noggrant 3x med 1 ml PBS.
    1. Upprepa tvättsteg 5.8.
  11. Avlägsna PBS genom aspiration, tillsätt sedan 2 ml varmt DMEM kompletterat med 50 μg/ml gentamicin till varje brunn och inkubera i 60 minuter vid 37 °C med 5 % CO2 %.
  12. Tvätta infekterade HT-29-celler noggrant 3x med 1 ml PBS.
    1. Upprepa tvättsteg 5.8.
  13. Avlägsna PBS genom aspiration och lyse HT-29-celler genom att tillsätta 1 ml PBS + 1 % Triton X-100 till varje brunn.
  14. Inkubera 6-hålsplattor vid 37 °C i 5 min.
  15. Använd en cellskrapa eller en böjd pipettspets för att skrapa de lyserade cellerna från botten av brunnen och överför hela 1 ml till ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör.
  16. Bestäm antalet intracellulära bakterier.
    1. Virvla varje rör (från steg 5.15) i minst 30 s för att ytterligare förskjuta Shigella från de lyserade eukaryota cellerna.
    2. Förbered 10-faldiga seriespädningar av lysat till PBS.
    3. Platta 100 μl av 1 x 10-2 och 1 x 10-3 spädningar på TSB + Kongo röd platta och inkubera över natten vid 37 °C.
      Anmärkning: Plätering av 100 μl från 1 x 10-2 och 1 x 10-3 utspädningar motsvarar en slutlig utspädningsfaktor på 1 x 10-3 respektive 1 x 10-4.

6. Analys av intracellulär replikation

OBS: Alla volymer överensstämmer med en analys med två 6-brunnsplattor.

  1. Subkultur över en natt Shigella-kulturer via 1:50 utspädning till färska medier.
    1. Vortex, tillsätt sedan 100 μL av varje nattkultur till 5 ml färsk TSB eller TSB + BS i ett odlingsrör av lämplig storlek.
      OBS: Begränsa odlingsvolymen till <20 % av odlingskolvens eller rörets volym för att säkerställa korrekt luftning.
    2. Inkubera vid 37 °C med skakning vid 250 varv per minut tills cellerna når en OD600 på 0,7 (mitten av logaritmningsfasen av Shigella-tillväxten ). ca 2-2,5 h.
      OBS: Under subkulturen, alikvot 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamicin och en tillräcklig volym PBS för alla tvättsteg och placera i ett 37 °C vattenbad. Låt materialet nå 37 °C före användning.
  2. Överför 2 x 108 CFUs subodlade Shigella till individuella 2 ml mikrocentrifugrör.
    OBS: 2 x 108 CFU motsvarar cirka 1 ml bakterieceller vid en OD600 på 0,7. Använd OD600-avläsningar för att approximera CFU/ml enligt kalibreringen av varje enskild spektrofotometer.
  3. Tvätta Shigella-prover 1x med PBS.
    1. Pelletsceller genom centrifugering vid 17 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten, tillsätt sedan 1 ml varm PBS och återsuspendera pelleten väl, pipettera försiktigt provet upp och ner tills blandningen är helt homogen (8-10x).
    2. Upprepa steg 6.3.1. 1x extra tid.
    3. Pelletceller genom centrifugering vid 17 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten och återsuspendera pelletsen i 2 ml varm DMEM.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av resuspenderade bakterier kommer att vara 1 x 108 CFU/ml.
  4. Vortex tillsätts sedan 1 ml (1 x 108 CFU) återsuspenderad Shigella plus 1 ml DMEM till varje brunn med beredda HT-29 kolonepitelmonolager i 6-hålsplattor (från steg 3.2.10.2).
    OBS: Infektioner utförs normalt vid en infektionsmultiplicitet (MOI; förhållandet mellan bakterieceller och epitelceller) på 100. För att testa olika MOI, späd ut återsuspenderad Shigella i DMEM till önskad koncentration och tillsätt sedan 1 ml utspädda bakterier till HT-29-monolager. Till exempel, för att testa en MOI på 10, späd bakterier 1:10 genom att tillsätta 150 μL 1 x 108 CFU/ml bakterier till 1,35 ml DMEM och applicera sedan 1 ml (1 x 107 CFU) på HT-29-celler.
  5. För att främja bakteriell kontakt med HT-29-cellerna, centrifugera 6-hålsplattorna vid 2 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur eller 37 °C om temperaturinställningen kan justeras.
    OBS: Centrifugering främjar bakteriell kontakt med HT-29-cellerna, vilket kringgår behovet av vidhäftningsfaktorer och gör att bakterierna snabbt kan invadera cellerna.
  6. Inkubera 6-hålsplattor vid 37 °C med 5 % CO2 i 45 min.
  7. Under inkubationen bestäms den bakteriella infektionstitern.
    1. Förbered 10-faldiga seriespädningar av återsuspenderade Shigella-celler (från steg 6.3.3) till PBS.
    2. Platta 100 μl av spädningarna 1 x 10-5 och 1 x 10-6 på TSB + Kongo och inkubera över natten vid 37 °C.
      Anmärkning: Plätering av 100 μl från 1 x 10-5 och 1 x 10-6 utspädningar motsvarar en slutlig utspädningsfaktor på 1 x 10-6 respektive 1 x 10-7.
  8. Tvätta infekterade HT-29-celler noggrant 3x med 1 ml PBS.
    1. Aspirera media från varje brunn.
      OBS: När du aspirerar media från 6-brunnsplattor, styr spetsen på sugen längs undersidan av brunnarna och försök undvika kontakt med HT-29-cellerna.
    2. Tillsätt 1 ml varm PBS i varje brunn och tvätta försiktigt.
      OBS: För att försiktigt tvätta 6-brunnars monolager med PBS, flytta plattan upp och ner och från sida till sida på bänkskivan. Att tvätta tallrikar i en cirkulär rörelse och/eller ta bort plattan från bänkytan kan orsaka mekaniskt avlägsnande av celler från plast.
    3. Upprepa steg 6.8.1 och 6.8.2 ytterligare 2 gånger.
  9. Avlägsna PBS genom aspiration, tillsätt sedan 2 ml varmt DMEM kompletterat med 50 μg/ml gentamicin till varje brunn och inkubera i 30 minuter vid 37 °C med 5 % CO2 %.
  10. Tvätta infekterade HT-29-celler noggrant 3x med 1 ml PBS.
    1. Upprepa tvättsteg 6.8.
  11. Avlägsna PBS genom aspiration, tillsätt sedan 2 ml varmt DMEM med 50 μg/ml gentamicin till varje brunn på 6-hålsplattorna och inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 under önskad tid för att möjliggöra intracellulär replikation (upp till 24 timmar).
  12. Tvätta cellerna noggrant 2x med 1 ml PBS.
    1. Upprepa tvättsteg 6.8.
  13. Avlägsna PBS genom aspiration och lyse HT-29-celler genom att tillsätta 1 ml PBS + 1 % Triton X-100 till varje brunn.
  14. Inkubera 6-hålsplattor vid 37 °C i 5 min.
  15. Använd en cellskrapa eller böjd pipettspets för att skrapa de lyserade cellerna från botten av brunnen och överför hela 1 ml till ett nytt 1,7 ml mikrocentrifugrör.
  16. Bestäm antalet intracellulära bakterier.
    1. Virvla varje rör (från steg 6.15) i minst 30 s för att ytterligare förskjuta Shigella från de lyserade eukaryota cellerna.
    2. Förbered 10-faldiga seriespädningar av lysat till PBS.
    3. Platta 100 μl av 1 x 10-2, 1 x 10-3 och 1 x 10-4 spädningar på TSB + Kongo Red plattor och inkubera över natten vid 37 °C.
      Anmärkning: Plätering av 100 μL från 1 x 10-2, 1 x 10-3 och 1 x 10-4 utspädningar motsvarar en slutlig utspädningsfaktor på 1 x 10-3, 1 x 10-4 respektive 1 x 10-5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Följsamhets-, invasions- och intracellulära replikationsanalyser utfördes genom att jämföra S. flexneri 2457T vildtyp (WT) med S. flexneri ΔVF (ΔVF), en mutant som antas reglera Shigellas virulens negativt. Eftersom Shigella använder gallsalter som en signal för att reglera virulensen 17,18,47, utfördes experiment efter bakteriell subkultur i TSB-media samt TSB kompletterat med 0,4% (w/v) gallsalter 18. Exponering för gallsalter under subkultursteget fungerar som en förbehandling för att replikera tunntarmstransitering före koloninfektion 17,18,47. Figur 1 analyserar effekten av ΔVF-mutationen på förmågan hos S. flexneri att fästa vid HT-29 kolonepitelceller. Procentuell följsamhet plottas på y-axeln och representerar förhållandet mellan återvunna bakterier efter HT-29-lys standardiserat till antalet inmatade bakterier. Som förväntat hade både S. flexneri WT- och ΔVF-stammar en signifikant ökning av följsamheten när de subodlades med gallsaltertillskott jämfört med TSB utan gallsaltertillskott18. Det fanns dock ingen skillnad i vidhäftning till HT-29-celler mellan WT- och ΔVF-mutanta stammar inom varje subkulturbetingelse. Dessa data indikerar att ΔVF-mutationen inte har någon effekt på förmågan hos S. flexneri att fästa vid HT-29-epitelceller med eller utan förbehandling av gallsalter.

I figur 2 analyserades effekten av ΔVF-mutationen på förmågan hos S. flexneri att invadera (Figur 2A) och replikera (Figur 2B) inuti HT-29 kolonepitelceller med eller utan gallsalter förbehandling. Procentuell återhämtning plottas på y-axeln och representerar förhållandet mellan återvunna bakterieceller efter HT-29-celllys standardiserat till antalet ingående bakterier. I figur 2A sågs en förväntad signifikant ökning av förmågan hos WT S. flexneri 2457T att invadera HT-29-celler efter preexponering för gallsalter48, medan S. flexneri ΔVF-mutanten uppvisade en mindre ökning av invasionen efter förexponering av gallsalter jämfört med WT-stammen.  ΔVF-mutanten hade ökade invasionshastigheter av HT-29-celler jämfört med WT subkulturerade i TSB, men hade liknande invasionshastigheter som WT när de subodlades i TSB kompletterat med gallsalter (Figur 2A). Dessa resultat tyder på att ΔVF-mutationen förbättrar förmågan hos S. flexneri att invadera HT-29-celler, vilket minskar effekten av gallsalternas preexponering även om invasionsförmågan hos ΔVF-mutanten ökade ytterligare efter subkulturen av gallsalter.

Sammantaget återfanns 10 gånger fler bakterier efter inkubation över natten (Figur 2B) jämfört med 90 minuters inkubation (Figur 2A), vilket visar skillnaderna i övervakning av intracellulär tillväxt respektive invasion. När infekterade HT-29-celler inkuberades i 18 timmar för att möjliggöra intracellulär replikation av bakterierna (Figur 2B), minskade effekten av förbehandlingen av gallsalterna för både WT- och ΔVF-stammarna . Den minskade effekten av förbehandling av gallsalter under intracellulär replikation var dock mer dramatisk för ΔVF-mutanten . Eftersom ökningen av intracellulär replikation av båda stammarna när de preexponerades för gallsalter var mindre än ökningen av invasionshastigheter under samma förhållanden, antar vi att gallsalter har en större inverkan på de tidiga stegen i S. flexneri-patogenesen . ΔVF-mutanten uppvisade en ökning av procentuell återhämtning från replikation över natten inuti HT-29-celler jämfört med WT (figur 2B) efter båda subkulturförhållandena. De procentuella återhämtningarna av ΔVF-mutanten var dock likartade oavsett gallsalter före exponering. Dessa datatrender tyder på att ΔVF-mutanten replikerar mer effektivt inuti HT-29-celler jämfört med WT, och att förexponering av gallsalter inte påverkar ΔVF-mutantens förmåga att replikera intracellulärt, vilket observerats för WT (figur 2B). Eftersom skillnaden mellan mutant- och WT-stammarna i gallsalternas preexponeringstillstånd inte observerades under 90 minuters invasionsanalys, antar vi att produkten som kodas av den borttagna VF-genen också kan reglera S. flexneri-replikationen inuti HT-29-celler. Sammantaget visar båda analyserna att ΔVF-mutanten är mer virulent i förhållande till WT, vilket tyder på att VF-genprodukten är en negativ regulator av S. flexneri-virulens .

Figure 1
Figur 1: Gallsalter före exponering inducerade vidhäftning av S. flexneri till HT-29-celler. S. flexneri 2457T WT- och ΔVF-mutanta celler subodlades i antingen TSB eller TSB kompletterat med 0,4 % (w/v) gallsalter (TSB+BS) medier. Bakterierna applicerades sedan på HT-29-celler vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 100 och inkuberades i 3 timmar för att undersöka följsamheten. Efter inkubation tvättades och lyserades infekterade HT-29-celler, och seriespädningar av återvunna bakterier pläterades för att räkna upp kolonibildande enheter per ml (CFU/ml). Antalet vidhäftande bakterier plottas i förhållande till de ingående bakterietitrarna för att fastställa den procentuella följsamheten. Data är representativa för ett biologiskt replikat med tre tekniska replikat (enskilda punkter). Felstaplar anger medelvärdets standardfel (SEM). Statistisk signifikans bestämdes av Students t-test (*p < 0,05; ***p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Gallsalter före exponering ökade invasionen av WT S. flexneri och intracellulär replikation. S. flexneri 2457T WT- och ΔVF-mutanta celler subodlades i antingen TSB eller TSB kompletterat med gallsalter (TSB+BS) medier. Bakterierna applicerades sedan på HT-29-celler med ett MOI på 100, centrifugerades på cellerna och inkuberades vid 37 °C med 5 % CO2 i 45 minuter. Celler tvättades med PBS och extracellulära bakterier lyserades genom tillsats av gentamicin till DMEM för att uteslutande återvinna intracellulära bakterier. Efter 90 minuters inkubation (A, bakterieinvasion) eller 18 timmar (B, intracellulär replikation) tvättades och lyserades infekterade HT-29-celler, och seriespädningar av återvunna bakterier pläterades för att räkna upp kolonibildande enheter per ml (CFU/ml). Antalet intracellulära bakterier plottas i förhållande till de ingående bakterietitrarna för att fastställa den procentuella återhämtningen. Data är representativa för ett biologiskt replikat, vart och ett med tre tekniska replikat (enskilda punkter). Felstaplar indikerar SEM. Statistisk signifikans bestämdes av Students t-test (*p < 0,05). Observera skillnaderna i y-axelns skalor mellan panelerna (A) och (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver en uppsättning av tre standardiserade analyser för att studera Shigella-vidhäftning, invasion och intracellulär replikation av tarmepitelceller. Även om dessa metoder bara är modifierade versioner av klassiska gentamicinanalyser som används för att studera invasionen och intracellulär replikation av olika bakteriella patogener i värdceller 49,50,51, måste särskilda överväganden tillämpas när man studerar Shigella.

Shigella är fakultativa anaerober, som växer optimalt vid 37 °C i rikt medium med luftning43. När man utför dessa analyser för att undersöka effekterna av olika miljösignaler eller metaboliter på Shigella-infektioner, rekommenderas det att odla Shigella i rika medier över natten och sedan subkultur till definierade eller kompletterade medier till mitten av log-fasen före infektion. Maximalt virulensgenuttryck sker under den logaritmiska tillväxtfasen52,53. Således är subkulturering över natten av Shigella-kulturer och att tillåta bakterietillväxt till exponentiell fas (OD600 ~ 0,7) nödvändiga steg för att korrekt bedöma Shigella-virulens. Dessutom är virulensgenuttrycket temperaturberoende. För att säkerställa specificitet för uttryck endast under värdinfektion induceras virulensgener vid värdens fysiologiska temperaturer (37 °C) och undertrycks strikt vid lägre temperaturer (t.ex. 30 °C)54. För att säkerställa uttryck av virulensgener måste bakteriell subkulturation och infektioner utföras vid 37 °C, med vederbörlig försiktighet för att säkerställa att temperaturen inte sjunker under 37 °C. En stor virulensplasmid på 220 kilobas, som kodar för det molekylära maskineri som krävs för invasion och epitelcellsinfektion, är en viktig virulensdeterminant för alla Shigella spp5. Upprepad passage och långvarig tillväxt vid 37 °C främjar virulensplasmidinstabilitet, vilket resulterar i plasmidförlust och gör Shigella-celler avirulent55. För att säkerställa upprätthållande av virulensplasmid och uttryck av viktiga virulensgener rekommenderas att bakterier restreakas direkt från fryslager varannan vecka på färska TSB + Kongoröda indikatorplattor. Kongoröd agar kan användas för att skilja mellan vildtypsvirulenta (röda, CR+) kolonier och avirulenta (vita, CR-) kolonier som har förlorat virulensplasmiden45. Om virulensplasmidinstabilitet observeras upprepade gånger kan odlingar av Shigella inkuberas över natten vid 30 °C för att förhindra virulensplasmidförlust, följt av subkulturation vid 37 °C för att främja virulensgenuttryck43. Slutligen, om analyser med mutanter och/eller kompletterade stammar utförs, där antibiotikamarkörer finns i dessa bakteriestammar, rekommenderas att man använder lämpligt antibiotiskt urval under de bakteriella övernattnings- och subkulturstegen.

Användningen av HT-29-epitelmonolager har många fördelar för att studera de molekylära mekanismerna för Shigella-patogenes in vitro. Eftersom Shigella är en patogen som är anpassad till människan återspeglar smådjursmodeller inte exakt den karakteristiska patogenesen av shigellos som observerats hos människor36. Således möjliggör användningen av standardiserade protokoll för infektion av cellinjer som härrör från människa kvantitativ undersökning av enskilda steg i bakteriell patogenes för att karakterisera det molekylära samspelet mellan denna patogen och dess ursprungliga värd. Historiskt sett har HeLa-celler främst använts för att studera värd-patogeninteraktioner in vitro 25,56,57. HeLa-celler är dock en odödliggjord livmoderhalscancercellinje, som är icke-nativa värdceller för enteriska bakteriella patogener. Således har in vitro-studier av enterisk patogenes övergått till användning av kolonadenokarcinomcellinjer (t.ex. HT-29, Caco-2 och T84), som mer troget rekapitulerar tarmepitelmorfologi och kan odlas på transbrunnar som epiteliala monolager med differentierade apikala och basolaterala ytor 58,59,60. Även om varje cellinje har sina individuella styrkor och svagheter, används HT-29-celler i de analyser som beskrivs här på grund av fenotypiska likheter med tarmenterocyter och robust uttryck av cellytereceptorer och proinflammatoriska cytokiner 58,59,61. Var och en av dessa diskuterade modeller är dock cancerhärledda cellinjer med avvikande metaboliska och tillväxtfenotyper som inte korrekt representerar det naturliga fysiologiska tillståndet hos kolonepitelet in vivo58. De senaste framstegen inom mänsklig vävnadsodlingsteknik har gjort det möjligt att odla mänskliga tarmstamceller, erhållna från vävnadsbiopsier, till organoider eller enstaka tvådimensionella cellmonolager som rekapitulerar de olika celltyper som finns i den mänskliga mag-tarmkanalen 62,63,64 . Tarmorganoider kan differentieras för att inkludera enterocyter, slemproducerande bägarceller, M-celler och andra vävnadsspecifika celltyper. Nyligen genomförda studier har validerat användningen av dessa organoidmodeller för att studera enteriska patogener, inklusive olika Shigella spp., Salmonella enterica och Escherichia coli-patovarer 62,63,64. Även om organoider är mer exakta modeller av det mänskliga mag-tarmepitelet och till och med kan odlas under olika näringsförhållanden för att representera den globala befolkningen65, kräver deras relativa komplexitet betydande utbildning och teknisk expertis, vilket resulterar i högre kostnader och längre odlingstider jämfört med traditionella cancercellinjer58.

Detta protokoll beskriver metoder med medelhög genomströmning, där två 6-brunnars plattor används för totalt 12 monolager som är tillgängliga för testning. Experiment kan dock enkelt skalas upp för att öka antalet monolager som sås för att rymma ytterligare tekniska replikat, eller för att testa ytterligare Shigella-mutanter och miljösignaler. Vävnadsodlingsplattor med fler brunnar (t.ex. plattor med 12 brunnar eller 24 brunnar) kan också användas med lämpliga justeringar för att ta hänsyn till brunnar med mindre diametrar. Under de HT-29-tillväxtförhållanden som beskrivs i steg 3.2 är HT-29-titrar tillräckliga för sådd av cirka sex 6-hålsplattor efter odling från en T75-kolv, med tillräckligt många kvarvarande celler för att upprätthålla HT-29-cellkulturen. Vidare är sådd av HT-29-monolager och beredning av inokulerande bakteriesteg identiska mellan bakteriell vidhäftning, invasion och intracellulär replikationsanalyser. Således kan analyser som testar samma Shigella-stammar eller subkulturförhållanden enkelt utföras parallellt för att samtidigt undersöka rollen för varje experimentellt tillstånd i olika stadier av Shigella-infektion .

Återhämtningstitrarna för vidhäftande (steg 4), invaderade (steg 5) och intracellulära bakterier (steg 6) bestäms genom plätering av serieutspädningar av infekterade HT-29-celler efter lys, vilket möjliggör kvantitativ bedömning av effektiviteten av varje steg av Shigella-infektion. Centrifugeringsstegen i invasions- och intracellulära replikationsanalyser, baserade på klassiska analyser 49,50,51, främjar bakteriell kontakt med värdcellerna för omedelbar invasion och förbättrar invasionshastigheten. Således "hoppar centrifugering" över vidhäftningssteget, vilket senare upptäcktes vara en viktig aspekt av Shigella-infektion 17,18,19,66. Det är viktigt att notera att centrifugsteget inte kan utföras med polariserade epitelceller sådda på transbrunnar. För adherensanalysen tvingas dock inte vidhäftning genom centrifugering, och inget gentamicin tillsätts till de infekterade HT-29-cellerna före lys, vilket möjliggör räkning av vidhäftande bakterieceller. Volymen av vävnadsodlingsmedia reduceras till 1 ml (i motsats till 2 ml för invasions- och intracellulära replikationsanalyser) för att möjliggöra effektivare kontakt mellan bakterierna och HT-29-cellerna. Dessutom, beroende på vidhäftningshastigheten, kan en viss invasion och intracellulär replikation inträffa under 3 timmars inkubation, men mängden är vanligtvis försumbar (t.ex. endast 0,05 % av den återhämtade bakteriepopulationen efter värdcellslys). För att korrekt ta hänsyn till vidhäftande kontra intracellulära bakterier under 3-timmarsinkubationen rekommenderas dock att utföra parallella analyser, där, utöver det angivna protokollet, en andra platta inkuberas med 50 μg/ml gentamicin i 2 ml DMEM per brunn under totalt 45 minuter (15 minuters inkubation, tvätt, färskt DMEM + gentamycin i 30 minuter) för att noggrant lysera extracellulära bakterier. Efter HT-29-celllys som noterats i protokollet kan de intracellulära bakterierna räknas upp enligt ovan och kommer att representera antalet bakterier som invaderade. Detta värde kan sedan subtraheras från de bakterier som räknas upp från plattan utan gentamicinbehandling för att bestämma vidhäftande och invaderade bakterier på lämpligt sätt. Parallella analyser kan också utföras för att ge mer insikt i den intracellulära replikationen av Shigella inuti HT-29-celler efter invasion, t.ex. genom att använda flera tidpunkter för att utföra intracellulära tillväxtkurvor. Slutligen, tillsammans med att räkna intracellulära bakterier efter en 18 timmars gentamicininkubation, kan odlingssupernatanterna samlas in och analyseras för cytokinutsöndring av infekterade HT-29-celler. Till exempel är IL-8 ett kemokin som utsöndras av epitelceller som till stor del fungerar för att rekrytera PMN till infektionsstället. Mängden IL-8 som utsöndras i odlingsmediet hos infekterade HT-29-celler kan analyseras med en IL-8 ELISA-analys67.

Gallsalter har visat sig vara en viktig virulenssignal för Shigella under transitering genom det mänskliga mag-tarmsystemet och kan användas för att komplettera bakteriella tillväxtmedier i dessa protokoll för att replikera typiska GI-tillstånd. Naturligtvis introduceras gallsalter i tolvfingertarmen eller den övre delen av tunntarmen för att underlätta matsmältningen; Och i den terminala ileum eller änden av tunntarmen avlägsnas 95 % av gallsalterna och återvinns tillbaka till cirkulationen för slutlig deponering i gallblåsan68. Gallsalter har vanligtvis en koncentration mellan 0,2%-2,0% (w/v) i tunntarmen och är naturligt bakteriedödande. Shigella, tillsammans med de flesta enteriska bakterier, motstår dock gallsalter och använder signalerna för att förstärka infektionen47. Flera studier har dokumenterat hur exponering för gallsalter, ibland i kombination med andra tunntarmssignaler som glukos, påverkar Shigelas överlevnad och virulensreglering före infektion. Shigella har visat sig motstå gallsalter, förändra genuttryck och bilda och sprida en biofilm under förhållanden som reproducerar tunntarmstransitering 17,69. Studierna har visat att dessa förändringar resulterar i en hypervirulent fenotyp, där vidhäftning och invasion induceras vid efterföljande koloninfektion av Shigella 17,18,19,48,66. Således dokumenterar de förhållanden som beskrivs ovan hur man subodlar Shigella i gallsalter för att efterlikna tunntarmstransitering innan man utför vidhäftnings-, invasions- eller intracellulära replikationsanalyser. Den specificerade TSB-formuleringen innehåller tillsatt glukos i förhållande till typisk Luriabuljong (LB)17. Således, om LB används, är det viktigt att även komplettera mediet med glukos (0,5%-2,0% [w/v]) för att på lämpligt sätt ta hänsyn till glukossignalerna i tunntarmen17. Dessutom, som nämnts ovan, tvättas alla Shigella-subkulturer för att avlägsna gallsalter och efterlikna övergången till tjocktarmen för infektionsanalyser.

Traditionellt, och som framhållits i resultaten ovan (Figur 1 och Figur 2), är infektionsanalyser värdefulla för att bestämma en viss gens roll i Shigella-infektion . Fenotypen hos olika mutanter kan dock inte uppskattas utan korrekt tillskott av bakterieodlingsmediet. Som tidigare forskning har visat förändrar gallsalter signifikant S. flexneri-genuttrycket , inklusive gener för central metabolism, transkriptionsfaktorer, sockertransportörer, läkemedelsresistens och virulensgener som antingen kodas på kromosomen eller virulensplasmid17. Dessa gener ger insikt i hur Shigella använder gallsalter som en signal för att förändra genuttryck och förbereda för eventuell infektion i tjocktarmen, och efterföljande mutationsanalyser måste därför utföras i lämpliga kompletterade bakteriella tillväxtmedier innan man undersöker effekter på virulens i vidhäftnings-, invasions- och intracellulära replikationsanalyser. Som framgår ovan i figur 1 och figur 2 påverkade ΔVF-mutationen inte vidhäftningen men påverkade invasion och intracellulär replikation. Eftersom mutationen förstärkte invasionen och den intracellulära replikationen pågår just nu experiment för att ta reda på hur genprodukten reglerar infektionen. De muterade analyserna fungerar som ett exempel på hur nya förståelser av Shigellas patogenes kan studeras, särskilt under förhållanden som bättre replikerar den mänskliga mag-tarmkanalen. Lämpliga komplementeringsanalyser rekommenderas för att validera fenotyperna hos olika mutanter.

I kombination beskriver dessa procedurer kvantitativa experiment som kommer att ge viktig insikt i de molekylära mekanismerna för Shigellas vidhäftning till, invasion av och replikation inuti HT-29 kolonepitelceller genom att bäst efterlikna den naturliga miljön i den mänskliga mag-tarmkanalen under infektion. Framtida studier kan utöka mutanterna och experimentella förhållanden för att få en bättre förståelse för hur Shigella förbereder sig för och effektivt infekterar mänskliga värdar. Trots årtionden av forskning finns det fortfarande så mycket mer att upptäcka om Shigella-infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Stöd till författarna inkluderar Massachusetts General Hospital's Department of Pediatrics, Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF) award 2022A009041, National Institute of Allergy and Infectious Diseases anslag R21AI146405 och National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant Nutrition Obesity Research Center vid Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 204 Shigella vidhäftning invasion intracellulär replikation patogenes virulensfaktorer epitelceller gallsalter
Epitelcellsinfektionsanalyser med <em>Shigella</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, … More

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter