Summary
現在のプロトコルはin vitroの上皮細胞ラインを使用して赤痢菌の付着、侵入および細胞内複製を調査する伝染の試金を記述する。
Abstract
ヒトに適応した腸内細菌性病原体である赤痢菌は、毎年何百万人もの感染症を引き起こし、小児患者に長期的な増殖効果をもたらし、世界中で下痢による死亡の主な原因となっています。感染は、病原体が消化管を通過し、結腸を覆う上皮細胞に感染する結果として、水様または血性の下痢を誘発します。抗生物質耐性菌の驚異的な増加と承認されたワクチンの不足により、この手ごわい病原体を研究するには、標準化された研究プロトコルが不可欠です。ここでは、結腸上皮細胞における細菌の付着、浸潤、および細胞内複製のin vitro分析を使用して、赤痢菌の分子病因を調べるための方法論を紹介します。感染分析に先立ち、赤痢菌コロニーの病原性表現型は、寒天プレート上のコンゴ赤色色素の取り込みによって検証されました。また、バクテリア培養中にin vivo条件を模倣するために、サプリメントを添加した実験用培地を検討することもできます。次に、細菌細胞を標準化されたプロトコルで使用し、感染の各段階を分析するための適応を伴う感染の確立された多様性で、組織培養プレート内の結腸上皮細胞に感染します。アドヒアランスアッセイでは、赤痢菌細胞を培地レベルを下げてインキュベートし、細菌と上皮細胞との接触を促進します。浸潤アッセイと細胞内複製アッセイの両方で、ゲンタマイシンをさまざまな時間間隔で適用して細胞外細菌を排除し、浸潤の評価および/または細胞内複製速度の定量化を可能にします。すべての感染プロトコルは、感染した上皮細胞溶解物を段階的に希釈し、コンゴ赤寒天プレート上の感染力価と比較して細菌コロニー形成単位をめっきすることにより、付着細菌、侵入細菌、および/または細胞内細菌を列挙します。これらのプロトコルを組み合わせることで、上皮細胞の赤痢菌感染の各段階について、独立した特性評価と比較が可能になり、この病原体の研究に成功します。
Introduction
腸内細菌性病原体によって引き起こされる下痢性疾患は、世界的な健康上の重大な負担です。2016年、下痢性疾患は世界で130万人の死亡の原因となり、5歳未満の子供の死因の第4位でした1,2。グラム陰性腸内細菌性病原体である赤痢菌は、世界中で下痢による死亡の主な原因である赤痢症の原因物質です3。赤痢症は、低・中所得国の子どもに毎年重大な罹患率と死亡率を引き起こし4,5、高所得国での感染は、保育所、食品媒介、水媒介の発生に関連しています6,7,8,9。効果のないワクチン開発10と薬剤耐性(AMR)11,12の上昇により、大規模な赤痢菌の集団発生の管理が複雑になっています。米国疾病管理予防センター(CDC)の最近のデータによると、2020年には米国における赤痢菌感染症の約46%が薬剤耐性を示しており13,14、世界保健機関(WHO)は赤痢菌をAMRの優先病原体として宣言しており、新しい治療法が緊急に必要とされています15。
赤痢菌感染症は、汚染された食品や水を摂取すると、糞便-経口経路を介して、または直接の人間との接触を介して容易に伝染します。赤痢菌は、効率的なヒト適応病原体に進化し、10〜100個の細菌の感染量で病気を引き起こすのに十分です16。小腸の通過中、赤痢菌は高温や胆汁などの環境信号にさらされます17。これらのシグナルを検出すると、転写変化が誘発され、細菌がヒト結腸に感染する能力を高める病原性因子が発現します17,18,19。赤痢菌は頂端表面から結腸上皮に侵入するのではなく、卵胞関連上皮内の特殊な抗原提示微小蕾細胞(M細胞)への取り込みに続いて上皮層を横切って通過します20,21,22。トランスサイトーシス後、赤痢菌細胞は常在マクロファージによって貪食されます。赤痢菌は急速にファゴソームから脱出し、マクロファージ細胞死を引き起こし、炎症誘発性サイトカインを放出します5,23,24。次に、赤痢菌は基底側から結腸上皮細胞に侵入し、マクロピノサイト液胞を溶解し、細胞質に複製ニッチを確立します5,25。炎症誘発性サイトカイン、特にインターロイキン-8(IL-8)は、多形核好中球白血球(PMN)を感染部位に動員し、上皮のタイトジャンクションを弱め、上皮内膜への細菌浸潤を可能にして基底側感染を悪化させます5。PMNは感染を封じ込めるために感染した上皮内膜を破壊し、その結果、細菌性(血性)赤痢の特徴的な症状が現れる5。浸潤と細胞内複製のメカニズムは徹底的に特徴付けられていますが、新しい研究は、消化管(GI)通過中の病原性調節17、アドヒアランス19、バリア透過性による基底側アクセスの改善26、栄養失調の小児における無症候性輸送27など、赤痢菌感染における重要な新しい概念を実証しています。
赤痢菌が下痢性疾患を引き起こす能力は、ヒトおよびヒト以外の霊長類(NHP)に限定されています28。赤痢菌の腸管感染モデルは、ゼブラフィッシュ29、マウス30、モルモット31、ウサギ21、32、33、ブタ34、35について開発されています。しかし、これらのモデルシステムのどれも、ヒト感染中に観察された疾患特性を正確に再現することはできない36。赤痢症のNHPモデルは赤痢菌の病因を研究するために確立されていますが、これらのモデルシステムは実装に費用がかかり、人為的に高い感染線量を必要とし、ヒトの感染線量よりも最大9桁高い37、38、39、40、41、42。したがって、ヒト宿主の感染に対する赤痢菌の顕著な適応は、赤痢菌の病因を正確に調べるための生理学的に適切なモデルを再現するために、ヒト由来の細胞培養の使用を必要とします。
ここでは、HT-29結腸上皮細胞への 赤痢菌 の付着、浸潤、および複製の速度を測定するための詳細な手順について説明します。これらの標準化されたプロトコルを使用して、細菌の病原性遺伝子と環境シグナルが 赤痢菌 感染の各ステップに影響を与える分子メカニズムを調べて、動的な宿主と病原体の相互作用関係をよりよく理解することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 試薬・材料の調製
注:すべての容量は、2 枚の 6 ウェルプレートを使用したアッセイと一致しています。
- TSB培地:0.5 Lの脱イオン(DI)水を15 gのトリプシン大豆ブロス(TSB、 材料表を参照)培地とオートクレーブに加えます。室温で保存してください。
- 胆汁塩培地(TSB + BS):0.4%(w/v)胆汁塩を含むTSBを調製するには、0.06 gの胆汁塩(BS、 材料表を参照)を15 mLのオートクレーブ滅菌したTSBに再懸濁します。0.22μmのPESフィルターを使用してフィルター滅菌します。
注:胆汁塩は、コール酸ナトリウムとデオキシコール酸ナトリウムの1:1混合物で構成されています。使用直前に新しいメディアを準備してください。 - DMEM + 10% (v/v) FBS: 5 mL のウシ胎児血清 (FBS) を 45 mL の Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) に加えます。4°Cで保存してください。
- DMEM + ゲンタマイシン:50 mL チューブに 50 mL の DMEM と 50 μL の 50 mg/mL ゲンタマイシンを加えます( 材料表を参照)。
注:各実験の前に、新鮮なアリコートを作り、37°Cの水浴で温めてください。 - PBS + 1% (v/v) Triton X-100:150 μL の Triton X-100 を 15 mL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加えます。
注:各実験の前に、新鮮なアリコートを作り、37°Cの水浴で温めてください。 - TSB + コンゴレッドインジケータープレート:1 LボトルにTSB15 g、厳選寒天7.5 g、コンゴレッド染料0.125 g( 材料表を参照)を加えます。0.5Lの脱イオン水とオートクレーブを加えます。10〜20 mLの培地を個々の滅菌ペトリ皿(100 mm x 15 mm)に注ぎ、固化させます。
注意:コンゴレッドは発がん性があり、生殖毒素です。コンゴレッドの取り扱いは、適切な個人用保護具を使用して行われるようにしてください。詳細については、製品安全データシートを参照してください。
注:約20枚のプレートは、0.5Lのコンゴレッド培地から作られています。プレートは2〜3日前に準備し、使用するまで室温で反転させておくことができます。長期保存の場合は、逆さにしたプレートをプラスチックスリーブに入れ、4°Cで最大3か月間保管します。 - DMEM + 10% (v/v) FBS および 5% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO): 42.5 mL の DMEM、5 mL の FBS、2.5 mL の DMSO を 50 mL のチューブに加えます。4°Cで保存してください。
2.バクテリアの準備
注:すべての 赤痢菌 実験室の培養および保管プロトコルは、Payne、SM43から適合しています。
注意: 赤痢菌 はリスクグループ2の病原体44です。 赤痢菌 属菌の感染性が低いため、偶発的な曝露を制限するために追加の安全対策を講じて、すべての実験室作業をBSL-2環境で実施します。
- 冷凍株からの 赤痢菌 の増殖
- 滅菌アプリケーターを使用して、少量の凍結培養を極低温バイアルからTSB + Congo Red寒天プレートに移します。
- 接種ループを火炎滅菌し、冷まします。プレートの1つの象限を横切って前後に縞模様の接種を行います。ループを炎で燃やし、冷ましてから、プレートの第1象限から第2象限に縞模様を描きます。繰り返して、プレートの第3象限と第4象限に接種を縞模様にします。
注:または、各象限の間に新しい滅菌アプリケーターを使用して接種をストリークします。 - プレートを反転させ、37°Cで一晩インキュベートします。
注:コンゴ赤色陽性(CR+)表現型45の観察に必要な赤痢菌病原性因子の発現には、≥37°Cでのインキュベーションが必要です。病原性コロニーは白い外観をしており、侵襲的ではありません。 - プレートをパラフィンフィルムで密封し、4°Cで冷蔵保存します。
注:細菌コロニーは寒天プレート上で1〜2週間生存可能です。
- 液体培養における 赤痢菌 の一晩増殖
- 3 mL の TSB 培地を滅菌 14 mL 培養チューブに分注します。
- 滅菌アプリケーターを使用して、十分に単離された赤色(CR+)コロニーを1つ選び、液体培地に再懸濁します。
- 培養物を37°Cで一晩(16〜18時間)インキュベートし、毎分250回転(rpm)で振とうします。
3. HT-29真核細胞の調製
注:すべての容量は、2 枚の 6 ウェルプレートを使用したアッセイと一致しています。HT-29細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)から入手しました。HT-29のメンテナンスプロトコルは、ATCC勧告46から採用されています。すべての培地は、使用前に37°Cのウォーターバスで予熱する必要があります。すべてのHT-29メンテナンスプロトコルは、バイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。培地中のHT-29細胞と混合/作業する際には、pHの劇的な変化を避けるために気泡の発生を控えてください。
- 凍結ストックからのHT-29細胞の融解
- HT-29細胞のバイアルを37°Cのウォーターバスで解凍します。
注意: 汚染を避けるために、キャップが水面から完全に浮かんでいることを確認してください。解凍には2分もかかりません。 - 培養物が完全に解凍された直後にバイアルを水から取り出し、70%エタノールで除染します。この時点からすべてのステップが無菌技術を使用して実行されていることを確認してください。
- バイアルのすべての内容物を、9 mL の DMEM + 10% FBS を含む 15 mL 遠心チューブに加えます。室温で125 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を廃液容器にデカントし、ペレットを10 mLの温かいDMEM + 10% FBSに再懸濁します。再懸濁した細胞を、10 mLの温かいDMEM + 10% FBS(総容量20 mL)を含む75 cm2 の組織培養フラスコ(T75)に移します。
- 細胞が90%のコンフルエント度に達するまで、5%CO2 で37°Cで細胞をインキュベートします(約6〜7日)。
注:コンフルエンシーは、視覚的な近似によって推定されます。
- HT-29細胞のバイアルを37°Cのウォーターバスで解凍します。
- HT-29細胞の播種
- 20 mL の PBS と 50 mL の DMEM + 10% FBS を 37 °C のウォーターバスで予熱し、3 mL の 0.25% (w/v) トリプシン-EDTA を室温に予熱します。
- HT-29細胞(ステップ3.1から)が90%のコンフルエントに達したら、HT-29細胞培養培地をT75フラスコから廃液容器にデカントします。~10 mLの温かいPBSをフラスコに注ぎ、静かに渦巻かせて洗浄します。PBSを廃液容器にデカントします。再び温かいPBSで洗浄し、デカントします。
- 2〜3 mLの0.25%(w / v)トリプシン-EDTAを加え、表面積全体を静かに渦巻きさせます。37°C、5%CO2 で4分間インキュベートします。
- インキュベーターからフラスコを取り出し、トリプシン-EDTAを静かに渦巻きさせ、すべての細胞が表面から剥離することを視覚的に確認します。
- 直ちに6 mLのウォームDMEM + 10% FBSを加えて、トリプシンを不活性化します。ピペットで上下に動かして、完全に混ぜます。
- すべての内容物を15 mLの遠心チューブに移し、室温で500 x g で5分間回転させます。
- 上清を廃液容器に静かにデカントし、ペレットを6 mLの温かいDMEM + 10% FBSに再懸濁します。
- 再懸濁後すぐに、懸濁したHT-29細胞10 μLを培養の途中から0.2 mLのPCRチューブに移します。10 μLのトリパンブルー色素をPCRチューブに加え、混合します。
- 10 μL の HT-29 細胞/トリパンブルーミックスを、使い捨ての Countess 細胞カウンターチャンバースライドに加えます( 材料表を参照)。生細胞の数を列挙し、細胞生存率を計算します。
注:サンプル中の細胞数を文書化する場合は、総細胞数ではなく、「生」細胞数の下の数値を読み取ります。あるいは、血球計算盤を用いて細胞の列挙を手動で行うこともできます。 - 再懸濁したHT-29細胞を新しいT75フラスコまたは6ウェルプレートに播種します。
- T75フラスコの場合:
- ピペットで静かに混合し、以下の式に従って2.5 x 106 細胞を新しいT75フラスコに移します。
- ウォームDMEM + 10% FBS培地を最終容量20 mL(最終濃度1.25 x 105 細胞/mL)に添加します。
- 前後に静かに揺らして、フラスコ全体に細胞を均等に分散させます。
- 細胞のコンフルエント度が80%に達するまで、5%CO2 で37°Cでインキュベートします。
注:最適な増殖のために、DMEM + 10% FBS培地をT75フラスコに~3日ごとに交換してください。培地を廃液容器にデカントし、10 mLの温かいPBSをフラスコに加えます。PBSを静かに回し、廃液容器にデカントします。次に、20 mLの新鮮で温かいDMEM + 10% FBSをフラスコに加え、37°C、5% CO2 インキュベーターに戻します。
- ピペットで静かに混合し、以下の式に従って2.5 x 106 細胞を新しいT75フラスコに移します。
- 6ウェルプレートの場合:
- ピペットで静かに混合し、以下の式に従って 5.85 x 106 個の細胞を新しい 50 mL コニカルチューブに移します。
- ウォームDMEM + 10% FBS培地を最終容量26 mL(最終濃度2.25 x 105 細胞/mL)に添加します。
- ピペットで静かに混合し、2 mL(4.5 x 105 セル)を 6 ウェルプレートの個々のウェルに分注します。
- 上下左右に2〜3回静かに揺らして、ウェル全体に細胞を均等に分散させます。
- 細胞が80%〜95%のコンフルエントに達するまで、37°Cで5%CO2 でインキュベートします(約3〜4日)。
注:浸潤および細胞内複製アッセイには85%のコンフルエンシーが推奨され、アドヒアランスアッセイには90%〜95%のコンフルエンシーが推奨されます。細胞は、48時間のインキュベーション後に~85%のコンフルエントに達し、最終濃度は約1 x 106 細胞/ウェルになります。播種する細胞の数とインキュベーションの長さの調整が必要な場合があります。
- ピペットで静かに混合し、以下の式に従って 5.85 x 106 個の細胞を新しい 50 mL コニカルチューブに移します。
- T75フラスコの場合:
- 冷凍HT-29ストックの製造
- 1 mL の DMEM + 10% FBS + 5% DMSO 培地を個々の極低温バイアルに分注します。
- ステップ3.2.7のHT-29細胞1×10を6個各バイアルに加えます。以下の式に従ってセルの体積を計算します。
- HT-29細胞は、液体窒素蒸気貯蔵冷凍庫で-130°C以下で長期間保管してください。
4. アドヒアランスアッセイ
注:すべての容量は、2 枚の 6 ウェルプレートを使用したアッセイと一致しています。
- 赤痢菌を一晩継代培養し、1:50に希釈して新鮮な培地に培養します。
- ボルテックスし、適切なサイズの培養チューブに入れた5 mLの新鮮なTSBまたはTSB + BSに、各100 μLの一晩培養液を加えます。
注:適切な曝気を確保するために、培養液の容量を培養フラスコまたはチューブの容量の<20%に制限してください。 - 細胞が光学密度(OD600)0.7( 赤痢菌 増殖の対数中期)に達するまで、250rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。約2〜2.5時間。
注:継代培養中に、50 mLのDMEMとすべての洗浄ステップに十分な量のPBSを分注し、37°Cのウォーターバスに入れます。使用前に培地を37°Cにしてください。
- ボルテックスし、適切なサイズの培養チューブに入れた5 mLの新鮮なTSBまたはTSB + BSに、各100 μLの一晩培養液を加えます。
- 2 x 108 コロニー形成ユニット(CFU)を継代培養した 赤痢菌 を個々の2 mL微量遠心チューブに移します。
注:2 x 108 CFUは、OD600 0.7で約1 mLの細菌細胞に相当します。OD600 の測定値を使用して、個々の分光光度計の校正に従ってCFU/mLを概算します。 - 赤痢菌サンプルをPBSで2回洗浄します。
- 室温で2分間、17,000 x g で遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を吸引し、1 mLの温かいPBSを加えてペレットをよく再懸濁し、混合物が完全に均一になるまで(8〜10倍)サンプルを静かに上下にピペッティングします。
- 手順4.3.1をさらに1回繰り返します。
- 室温で17,000 x g で2分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引し、ペレットを2 mLの温かいDMEMに再懸濁します。
注:再懸濁された細菌の最終濃度は、1 x 108 CFU/mLです。
- ボルテックスし、次に1 mL(1 x 108 CFU)の再懸濁赤 痢 菌を、6ウェルプレートで調製したHT-29結腸上皮単層の各ウェルに加えます(ステップ3.2.10.2から)。
注:感染は通常、感染の多様性(MOI:細菌細胞と上皮細胞の比率)が100の場合に行われます。さまざまなMOIを試験するには、赤 痢菌 を温かいDMEMで所望の濃度に希釈し、希釈した細菌1 mLをHT-29単分子膜に加えます。例えば、MOIが10の場合、150 μLの1 x 108 CFU/mLのバクテリアを1.35 mLのウォームDMEMに添加してバクテリアを1:10に希釈し、1 mL(1 x 107 CFU)をHT-29細胞に塗布します。 - 6ウェルプレートを37°C、5%CO2 で3時間インキュベートします。
- インキュベーション中に、細菌感染力価を決定します。
- 再懸濁した 赤痢菌 細胞(ステップ4.3.3から)をPBSに10倍段階希釈液を調製します。
- 希釈液1 x 10-5 および1 x 10-6 希釈液100 μLをTSB + Congo Redプレートに播種し、37°Cで一晩インキュベートします。
注:1 x 10-5 および 1 x 10-6 希釈液から 100 μL をめっきすると、それぞれ 1 x 10-6 および 1 x 10-7 の最終希釈係数に相当します。
- インキュベーション後、単層をPBSで4〜5回洗浄します。
- 各ウェルから培地を吸引します。
注:6ウェルプレートから培地を吸引する場合は、HT-29細胞との接触を避けながら、アスピレーターの先端をウェルの底面に沿ってガイドします。 - 各ウェルに温かいPBS1 mLを加え、穏やかに洗浄します。
メモ:PBSで6ウェル単層を優しく洗浄するには、ベンチトップでプレートを上下左右に動かします。プレートを円を描くように洗浄したり、ベンチトップの表面からプレートを取り外したりすると、プラスチックから細胞が機械的に除去される可能性があります。 - 手順4.7.1と4.7.2をさらに4回繰り返します。
- 各ウェルから培地を吸引します。
- 吸引によりPBSを除去し、各ウェルにPBS + 1% Triton X-100 1 mLを添加してHT-29細胞を溶解します。
- 6ウェルプレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 細胞スクレーパーまたは曲がったピペットチップを使用して、溶解した細胞をウェルの底からこすり落とし、1 mL全体を新しい1.7 mLの微量遠心チューブに移します。
- 細胞関連細菌の数を決定します。
- 各チューブ(ステップ4.10から)を少なくとも30秒間ボルテックスして、溶解した真核細胞から 赤痢菌 をさらに置換します。
- ライセートを PBS に 10 倍段階希釈して調製します。
- 希釈液1 x 10-2、1 x 10-3、1 x 10-4 希釈液100 μLをTSB + Congo Redプレートに播種し、37°Cで一晩インキュベートします。
注:1 x 10-2、1 x 10-3、1 x 10-4 希釈液から 100 μL をめっきすると、それぞれ 1 x 10-3、1 x 10-4、1 x 10-5 の最終希釈率に相当します。
5. 浸潤アッセイ
注:すべての容量は、2 枚の 6 ウェルプレートを使用したアッセイと一致しています。
- 赤痢菌を一晩継代培養し、1:50に希釈して新鮮な培地に培養します。
- ボルテックスし、適切なサイズの培養チューブに入れた5 mLの新鮮なTSBまたはTSB + BSに、各100 μLの一晩培養液を加えます。
注:適切な曝気を確保するために、培養液の容量を培養フラスコまたはチューブの容量の<20%に制限してください。 - 細胞がOD600 0.7( 赤痢菌 増殖の対数中期)に達するまで、250 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。約2〜2.5時間。
注:継代培養中に、50 mL の DMEM + 50 mg/mL ゲンタマイシンと、すべての洗浄ステップに十分な量の PBS を分注し、37 °C のウォーターバスに入れます。使用前に培地を37°Cにしてください。
- ボルテックスし、適切なサイズの培養チューブに入れた5 mLの新鮮なTSBまたはTSB + BSに、各100 μLの一晩培養液を加えます。
- 2 x 108 CFUsの継代培養赤 痢 菌を個々の2 mL微量遠心チューブに移します。
注:2 x 108 CFUは、OD600 0.7で約1 mLの細菌細胞に相当します。OD600 の測定値を使用して、個々の分光光度計の校正に従ってCFU/mLを概算します。 - 赤痢菌サンプルをPBSで1回洗浄します。
- 室温で2分間、17,000 x g で遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を吸引し、1 mLの温かいPBSを加えてペレットをよく再懸濁し、混合物が完全に均一になるまで(8〜10倍)サンプルを静かに上下にピペッティングします。
- 手順5.3.1を繰り返します。アディショナルタイム1倍。
- 室温で17,000 x g で2分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引し、ペレットを2 mLの温かいDMEMに再懸濁します。
注:再懸濁された細菌の最終濃度は、1 x 108 CFU/mLです。
- ボルテックスし、1 mL(1 x 108 CFU)の再懸濁赤 痢 液と1 mLのDMEMを、6ウェルプレートで調製したHT-29結腸上皮単層の各ウェルに加えます(ステップ3.2.10.2から)。
注:感染は通常、感染の多様性(MOI:細菌細胞と上皮細胞の比率)が100の場合に行われます。さまざまなMOIを試験するには、 赤痢菌 をDMEMで再懸濁して所望の濃度に希釈し、希釈した細菌1 mLをHT-29単分子膜に加えます。例えば、MOIが10の場合、150 μLの1 x 108 CFU/mLの細菌を1.35 mLのDMEMに添加して細菌を1:10に希釈し、次にHT-29細胞に1 mL(1 x 107 CFU)を加えます。 - HT-29細胞との細菌接触を促進するために、6ウェルプレートを2,000 x g で室温で10分間、または温度設定を調整できる場合は37°Cで遠心分離します。
注:遠心分離は、細菌とHT-29細胞との接触を促進し、接着因子の必要性を回避し、細菌が細胞に迅速に侵入することを可能にします。 - 6ウェルプレートを37°C、5%CO2 で45分間インキュベートします。
- インキュベーション中に、細菌感染力価を決定します。
- 再懸濁した 赤痢菌 細胞(ステップ5.3.3から)をPBSに10倍段階希釈液を調製します。
- 希釈液1 x 10-5 および1 x 10-6 希釈液100 μLをTSB + Congo Redプレートに播種し、37°Cで一晩インキュベートします。
注:1 x 10-5 および 1 x 10-6 希釈液から 100 μL をめっきすると、それぞれ 1 x 10-6 および 1 x 10-7 の最終希釈係数に相当します。
- 感染したHT-29細胞を1mLのPBSで3回徹底的に洗浄します。
- 各ウェルから培地を吸引します。
注:6ウェルプレートから培地を吸引する場合は、HT-29細胞との接触を避けながら、アスピレーターの先端をウェルの底面に沿ってガイドします。 - 各ウェルに温かいPBS1 mLを加え、穏やかに洗浄します。
メモ:PBSで6ウェル単層を優しく洗浄するには、ベンチトップでプレートを上下左右に動かします。プレートを円を描くように洗浄したり、ベンチトップの表面からプレートを取り外したりすると、プラスチックから細胞が機械的に除去される可能性があります。 - 手順5.8.1と5.8.2をさらに2回繰り返します。
- 各ウェルから培地を吸引します。
- PBSを吸引して除去し、50 μg/mLのゲンタマイシンを添加した2 mLの温かいDMEMを各ウェルに加え、5% CO2と37°Cで30分間インキュベートします。
- 感染したHT-29細胞を1mLのPBSで3回徹底的に洗浄します。
- 洗浄手順5.8を繰り返します。
- PBS を吸引して除去し、50 μg/mL のゲンタマイシンを添加した 2 mL の温かい DMEM を各ウェルに加え、5% CO2 と 37 °C で 60 分間インキュベートします。
- 感染したHT-29細胞を1mLのPBSで3回徹底的に洗浄します。
- 洗浄手順5.8を繰り返します。
- 吸引によりPBSを除去し、各ウェルにPBS + 1% Triton X-100 1 mLを添加してHT-29細胞を溶解します。
- 6ウェルプレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 細胞スクレーパーまたは曲がったピペットチップを使用して、溶解した細胞をウェルの底からこすり落とし、1 mL全体を新しい1.7 mLの微量遠心チューブに移します。
- 細胞内細菌の数を決定します。
- 各チューブ(ステップ5.15から)を少なくとも30秒間ボルテックスして、溶解した真核細胞から 赤痢菌 をさらに置換します。
- ライセートを PBS に 10 倍段階希釈して調製します。
- 希釈液1 x 10-2および希釈液1 x 10-3 100 μLをTSB + Congo Redプレートに播種し、37°Cで一晩インキュベートします。
注:1 x 10-2 および 1 x 10-3 希釈液から 100 μL をめっきすると、それぞれ 1 x 10-3 および 1 x 10-4 の最終希釈係数に相当します。
6. 細胞内複製アッセイ
注:すべての容量は、2 枚の 6 ウェルプレートを使用したアッセイと一致しています。
- 赤痢菌を一晩継代培養し、1:50に希釈して新鮮な培地に培養します。
- ボルテックスし、適切なサイズの培養チューブに入れた5 mLの新鮮なTSBまたはTSB + BSに、各100 μLの一晩培養液を加えます。
注:適切な曝気を確保するために、培養液の容量を培養フラスコまたはチューブの容量の<20%に制限してください。 - 細胞がOD600 0.7( 赤痢菌 増殖の対数中期)に達するまで、250 rpmで振とうしながら37°Cでインキュベートします。約2〜2.5時間。
注:継代培養中に、50 mL の DMEM + 50 mg/mL ゲンタマイシンと、すべての洗浄ステップに十分な量の PBS を分注し、37 °C のウォーターバスに入れます。使用前に培地を37°Cにしてください。
- ボルテックスし、適切なサイズの培養チューブに入れた5 mLの新鮮なTSBまたはTSB + BSに、各100 μLの一晩培養液を加えます。
- 2 x 108 CFUsの継代培養赤 痢 菌を個々の2 mL微量遠心チューブに移します。
注:2 x 108 CFUは、OD600 0.7で約1 mLの細菌細胞に相当します。OD600 の測定値を使用して、個々の分光光度計の校正に従ってCFU/mLを概算します。 - 赤痢菌サンプルをPBSで1回洗浄します。
- 室温で2分間、17,000 x g で遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を吸引し、1 mLの温かいPBSを加えてペレットをよく再懸濁し、混合物が完全に均一になるまで(8〜10倍)サンプルを静かに上下にピペッティングします。
- 手順6.3.1を繰り返します。アディショナルタイム1倍。
- 室温で17,000 x g で2分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引し、ペレットを2 mLの温かいDMEMに再懸濁します。
注:再懸濁された細菌の最終濃度は、1 x 108 CFU/mLです。
- ボルテックスし、1 mL(1 x 108 CFU)の再懸濁赤 痢 菌と1 mLのDMEMを、6ウェルプレート(ステップ3.2.10.2から)で調製したHT-29結腸上皮単層の各ウェルに加えます。
注:感染は通常、感染の多様性(MOI:細菌細胞と上皮細胞の比率)が100の場合に行われます。さまざまなMOIを試験するには、 赤痢菌 をDMEMで再懸濁して所望の濃度に希釈し、希釈した細菌1 mLをHT-29単分子膜に加えます。例えば、MOI 10 をテストするには、150 μL の 1 x 108 CFU/mL 細菌を 1.35 mL の DMEM に添加して細菌を 1:10 希釈し、次に 1 mL(1 x 107 CFU)を HT-29 細胞に適用します。 - HT-29細胞との細菌接触を促進するために、6ウェルプレートを2,000 x g で室温で10分間、または温度設定を調整できる場合は37°Cで遠心分離します。
注:遠心分離は、細菌とHT-29細胞との接触を促進し、接着因子の必要性を回避し、細菌が細胞に迅速に侵入することを可能にします。 - 6ウェルプレートを37°C、5%CO2 で45分間インキュベートします。
- インキュベーション中に、細菌感染力価を決定します。
- 再懸濁した 赤痢菌 細胞(ステップ6.3.3から)をPBSに10倍段階希釈液を調製します。
- 希釈液1 x 10-5 および1 x 10-6 希釈液100 μLをTSB + Congo Redプレートに播種し、37°Cで一晩インキュベートします。
注:1 x 10-5 および 1 x 10-6 希釈液から 100 μL をめっきすると、それぞれ 1 x 10-6 および 1 x 10-7 の最終希釈係数に相当します。
- 感染したHT-29細胞を1mLのPBSで3回徹底的に洗浄します。
- 各ウェルから培地を吸引します。
注:6ウェルプレートから培地を吸引する場合は、HT-29細胞との接触を避けながら、アスピレーターの先端をウェルの底面に沿ってガイドします。 - 各ウェルに温かいPBS1 mLを加え、穏やかに洗浄します。
メモ:PBSで6ウェル単層を優しく洗浄するには、ベンチトップでプレートを上下左右に動かします。プレートを円を描くように洗浄したり、ベンチトップの表面からプレートを取り外したりすると、プラスチックから細胞が機械的に除去される可能性があります。 - 手順6.8.1と6.8.2をさらに2回繰り返します。
- 各ウェルから培地を吸引します。
- PBSを吸引して除去し、50 μg/mLのゲンタマイシンを添加した2 mLの温かいDMEMを各ウェルに加え、5% CO2と37°Cで30分間インキュベートします。
- 感染したHT-29細胞を1mLのPBSで3回徹底的に洗浄します。
- 洗浄手順6.8を繰り返します。
- PBS を吸引して除去し、2 mL の温かい DMEM と 50 μg/mL のゲンタマイシンを 6 ウェルプレートの各ウェルに加え、37 °C で 5% CO2 と所望の時間インキュベートし、細胞内複製を可能にします(最大 24 時間)。
- 細胞を1 mLのPBSで2回徹底的に洗浄します。
- 洗浄手順6.8を繰り返します。
- 吸引によりPBSを除去し、各ウェルにPBS + 1% Triton X-100 1 mLを添加してHT-29細胞を溶解します。
- 6ウェルプレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 細胞スクレーパーまたは曲がったピペットチップを使用して、溶解した細胞をウェルの底からこすり落とし、1 mL全体を新しい1.7 mL微量遠心チューブに移します。
- 細胞内細菌の数を決定します。
- 各チューブ(ステップ6.15から)を少なくとも30秒間ボルテックスして、溶解した真核細胞から 赤痢菌 をさらに置換します。
- ライセートを PBS に 10 倍段階希釈して調製します。
- 希釈液1 x 10-2、1 x 10-3、1 x 10-4 希釈液100 μLをTSB + Congo Redプレートに播種し、37°Cで一晩インキュベートします。
注:1 x 10-2、1 x 10-3、1 x 10-4 希釈液から 100 μL をめっきすると、それぞれ 1 x 10-3、1 x 10-4、1 x 10-5 の最終希釈率に相当します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. flexneri 2457T野生型(WT)と、赤痢菌の病原性を負に制御すると仮定された変異体であるS. flexneri ΔVF(ΔVF)を比較して、アドヒアランス、浸潤、および細胞内複製アッセイを実施しました。赤痢菌は胆汁塩を病原性調節のシグナルとして使用するため17,18,47、実験は、TSB培地での細菌継代培養後、および0.4%(w / v)胆汁塩を添加したTSBの後に行われました18。継代培養段階での胆汁塩曝露は、結腸感染前の小腸通過を複製するための前処理として機能します17,18,47。図1は、S. flexneriがHT-29結腸上皮細胞に接着する能力に対するΔVF変異の影響を分析したものです。付着率はy軸にプロットされ、投入細菌数に対するHT-29溶解後に標準化された回収細菌の比率を表します。予想通り、S. flexneri WT株とΔVF株はどちらも、胆汁塩を添加していないTSBと比較して、胆汁塩を添加して継代培養した場合、アドヒアランスが有意に増加しました18。しかし、HT-29細胞への接着性は、各継代培養条件において、WT変異株とΔVF変異株の間で差はありませんでした。これらのデータは、ΔVF変異は、胆汁塩の前処理の有無にかかわらず、S.flexneriがHT-29上皮細胞に接着する能力に影響を与えないことを示しています。
図2では、胆汁塩の前処理の有無にかかわらず、HT-29結腸上皮細胞の内部に侵入し(図2A)および複製(図2B)するS.flexneriの能力に対するΔVF変異の影響が分析されました。回収率はY軸にプロットされ、投入細菌の数に対するHT-29細胞溶解後に回収された細菌細胞の比率を標準化して表しています。図2Aでは、胆汁塩への事前曝露後にHT-29細胞に侵入するWT S. flexneri 2457Tの能力の有意な増加が予想されたが48、S. flexneri ΔVF変異体はWT株と比較して、胆汁塩曝露後の浸潤の増加が小さかった。ΔVF変異体は、TSBで継代培養したWTと比較してHT-29細胞の浸潤率が高かったが、胆汁塩を添加したTSBで継代培養した場合の浸潤率はWTと同程度であった(図2A)。これらの結果は、ΔVF変異がS. flexneriのHT-29細胞への侵入能力を増強し、胆汁塩継代培養後にΔVF変異体の浸潤能力がさらに増加したにもかかわらず、曝露前の胆汁塩の影響を減少させることを示唆している。
全体として、90分間のインキュベーション(図2A)と比較して、一晩のインキュベーション後に10倍多くの細菌が回収され(図2B)、細胞内増殖のモニタリングと浸潤のモニタリングにそれぞれ違いがあることが示されています。感染したHT-29細胞を18時間インキュベートして細菌の細胞内複製を可能にすると(図2B)、WT株と ΔVF 株の両方で胆汁塩の前処理の影響が減少しました。しかし、細胞内複製中の胆汁塩前処理の効果の低下は、 ΔVF 変異体の方が劇的でした。胆汁塩に事前曝露した場合の両菌株の細胞内複製の増加は、同じ条件での侵入率の増加よりも小さかったため、胆汁塩は S.flexneri の病因の初期段階に大きな影響を与えるという仮説を立てています。 ΔVF 変異体は、両方の継代培養条件後、WT(図2B)と比較して、HT-29細胞内で一晩複製した際の回収率の増加を示しました。しかしながら、 ΔVF 変異体の回収率は、曝露前の胆汁塩に関係なく類似していた。これらのデータ傾向は、 ΔVF 変異体がWTと比較してHT-29細胞内でより効率的に複製し、WTで観察されたように、胆汁塩の曝露前の ΔVF 変異体の細胞内複製能力に影響を与えないことを示唆しています(図2B)。胆汁塩の曝露前条件における変異株とWT株の違いは、90分間の浸潤アッセイ中に観察されなかったため、欠失した VF 遺伝子によってコードされた生成物は、HT-29細胞内の S.flexneri 複製も制御している可能性があるという仮説を立てています。両方の解析を組み合わせると、 ΔVF 変異体はWTに比べて毒性が高いことが示され、 VF 遺伝子産物が S. flexneri 病原性の負の調節因子であることを示唆しています。
図1:曝露前の胆汁塩は、 S. flexneri のHT-29細胞への付着を誘導しました。 S. flexneri 2457T WTおよび ΔVF 変異細胞を、0.4%(w/v)胆汁塩(TSB+BS)培地を添加したTSBまたはTSBで継代培養しました。次に、細菌をHT-29細胞に感染多重度(MOI)100で適用し、3時間インキュベートして接着性を調べました。インキュベーション後、感染したHT-29細胞を洗浄して溶解し、回収した細菌の段階希釈液を播種して、コロニー形成単位/mL(CFU/mL)を列挙しました。付着菌の数は、入力細菌力価に対してプロットされ、付着率を確立します。データは、1 つの生物学的複製と 3 つのテクニカル複製(個々のドット)を表しています。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示します。統計的有意性は、スチューデントのt検定(*p < 0.05; ***p < 0.001)によって決定されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:曝露前の胆汁塩は、WT S. flexneri の浸潤と細胞内複製を増加させた。 S. flexneri 2457T WTおよび ΔVF 変異細胞を、胆汁塩(TSB+BS)培地を添加したTSBまたはTSBのいずれかで継代培養した。次に、バクテリアをMOI100でHT-29細胞に適用し、細胞に遠心分離し、37°Cで5%CO2 で45分間インキュベートしました。細胞をPBSで洗浄し、DMEMにゲンタマイシンを添加して細胞外細菌を溶解し、細胞内細菌のみを回収しました。90分(A、細菌の浸潤)または18時間(B、細胞内複製)のインキュベーション後、感染したHT-29細胞を洗浄して溶解し、回収した細菌の段階希釈液を播種して、mLあたりのコロニー形成単位(CFU/mL)を列挙しました。細胞内細菌の数は、入力された細菌力価に対してプロットされ、回収率を確立します。データは 1 つの生物学的複製を表しており、それぞれに 3 つのテクニカル複製 (個々のドット) があります。エラーバーはSEMを示します。 統計的有意性は、スチューデントのt検定(*p < 0.05)によって決定されました。パネル(A)と(B)のy軸スケールの違いに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは一組の腸の上皮セルの赤痢菌の付着、侵入および細胞内の複製を調査する3つの標準化された試金を記述する。これらの方法は、宿主細胞内のさまざまな細菌性病原体の侵入および細胞内複製を研究するために使用される古典的なゲンタマイシンアッセイの単なる修正版ですが49,50,51、赤痢菌を研究する際には特別な考慮事項を適用する必要があります。
赤痢菌は通性嫌気性菌であり、曝気43の豊富な培地中で37°Cで最適に成長します。赤痢菌感染症に対するさまざまな環境シグナルまたは代謝物の影響を調べるためにこれらのアッセイを実施する場合は、赤痢菌をリッチ培地で一晩培養し、感染前の中間期まで定義培地またはサプリメント培地に継代培養することをお勧めします。最大病原性遺伝子発現は、成長の対数期に発生します52,53。したがって、赤痢菌培養物を一晩継代培養し、細菌を指数関数的段階(OD600~0.7)まで増殖させることは、赤痢菌の病原性を適切に評価するために必要なステップです。さらに、病原性遺伝子の発現は温度依存的です。宿主感染時のみ発現の特異性を確保するために、病原性遺伝子は宿主の生理学的温度(37°C)で誘導され、より低い温度(例えば30°C)で厳密に抑制される54。病原性遺伝子の発現を確実にするために、細菌の継代培養と感染は、温度が37°Cを下回らないように適切な注意を払って、37°Cで行う必要があります。 浸潤と上皮細胞感染に必要な分子機構をコードする220キロ塩基の大きな病原性プラスミドは、すべての赤痢菌属菌5に必須の病原性決定因子です。継代を繰り返すと、37°Cで増殖が長引くと、病原性プラスミドが不安定になり、プラスミドが失われ、赤痢菌細胞が病原性55になります。病原性プラスミドの維持と重要な病原性遺伝子の発現を確実にするために、2週間ごとに冷凍ストックから新鮮なTSB + Congoレッドインジケータープレートに直接細菌を再ストリークすることをお勧めします。コンゴ赤寒天培地は、野生型病原性(赤、CR+)コロニーと、病原性プラスミド45を失った病原性(白色、CR−)コロニーを区別するために用いることができる。病原性プラスミドの不安定性が繰り返し観察される場合は、赤痢菌の一晩培養を30°Cでインキュベートして病原性プラスミドの損失を防ぎ、続いて37°Cで継代培養して病原性遺伝子の発現を促進することができます43。最後に、変異体および/または補完株を用いた分析を行い、これらの細菌株に抗生物質マーカーが存在する場合は、細菌の夜間および継代培養のステップで適切な抗生物質の選択を行うことが推奨されます。
HT-29上皮単分子膜の使用は、in vitroで赤痢菌の病因の分子メカニズムを研究するための多くの利点を有する。赤痢菌はヒトに適応した病原体であるため、小動物モデルはヒトで観察された赤痢症の特徴的な病因を正確に反映していない36。したがって、ヒト由来の細胞株の感染に標準化されたプロトコルを使用することで、細菌の病原性の個々のステップを定量的に調べて、この病原体とその天然宿主との間の分子相互作用を特徴付けることができます。歴史的に、HeLa細胞は主にin vitroで宿主と病原体の相互作用を研究するために使用されていました25,56,57。しかし、HeLa細胞は不死化子宮頸がん細胞株であり、腸内細菌病原体の非天然宿主細胞です。したがって、腸管病因のin vitro研究は、結腸腺癌細胞株(HT-29、Caco-2、およびT84など)の使用に移行しており、これは腸上皮の形態をより忠実に再現し、頂点および基底外側表面を分化した上皮単層としてトランズウェル上で増殖させることができる58,59,60.各細胞株には個別の長所と短所がありますが、HT-29細胞は、腸管細胞との表現型の類似性、および細胞表面受容体および炎症誘発性サイトカインの強力な発現により、ここで説明するアッセイに使用されます58,59,61。しかしながら、これらの議論されたモデルのそれぞれは、in vivoにおける結腸上皮の自然な生理学的状態を正確に表さない異常な代謝および増殖表現型を有する癌由来の細胞株である58。ヒト組織培養技術の最近の進歩により、組織生検から得られたヒト腸幹細胞を、ヒト消化管(GI)路に存在するさまざまな細胞タイプを再現するオルガノイドまたは単一の2次元細胞単層に培養することが可能になりました62,63,64.腸管オルガノイドは、腸細胞、粘液産生杯細胞、M細胞、およびその他の組織特異的細胞タイプを含むように分化することができます。最近の研究では、さまざまな赤痢菌、サルモネラ・エンテリカ、大腸菌病原体などの腸内病原体を研究するためのこれらのオルガノイドモデルの使用が検証されています62,63,64。オルガノイドはヒト消化管上皮のより正確なモデルであり、世界人口を表すためにさまざまな栄養条件で培養することさえできるが65、その相対的な複雑さは、かなりのトレーニングと技術的専門知識を必要とし、従来の癌細胞株と比較してコストが高く、培養時間が長くなります58。
このプロトコルでは、2枚の6ウェルプレートを合計12枚の単層でテストに用いるという、中程度のスループットの方法を説明しています。しかし、実験は簡単にスケールアップして、追加の技術的複製に対応するために播種する単層の数を増やしたり、追加の 赤痢菌 変異体や環境シグナルをテストしたりすることができます。より多くのウェルを有する組織培養プレート(例えば、12ウェルまたは24ウェルプレート)も、より小さな直径を有するウェルを考慮して適切な調整とともに使用することができる。ステップ3.2で概説したHT-29増殖条件下では、HT-29力価は、1つのT75フラスコから培養後に約6枚の6ウェルプレートを播種するのに十分であり、HT-29細胞培養を維持するのに十分な細胞が残っています。さらに、HT-29単層の播種および接種細菌の調製ステップは、細菌付着、浸潤、および細胞内複製アッセイの間で同一である。したがって、同じ 赤痢菌 株または継代培養条件を試験するアッセイを並行して容易に実施して、 赤痢菌 感染のさまざまな段階における各実験条件の役割を同時に調べることができます。
接着菌(ステップ4)、浸潤細菌(ステップ5)、細胞内細菌(ステップ6)の回収力価は、溶解後の感染HT-29細胞の段階希釈液を播種することによって決定され、赤痢菌感染の各段階の効率を定量的に評価することができます。古典的なアッセイ49,50,51に基づく浸潤および細胞内複製アッセイにおける遠心分離ステップは、細菌と宿主細胞との接触を促進して即時侵入させ、侵入率を高めます。したがって、遠心分離は、後に赤痢菌感染の重要な側面であることが発見された付着ステップを「スキップ」します17,18,19,66。遠心分離ステップは、トランズウェルに播種された分極上皮細胞では実行できないことに注意することが不可欠です。しかし、アドヒアランスアッセイでは、遠心分離によってアドヒアランスが強制されることはなく、溶解前に感染したHT-29細胞にゲンタマイシンを添加しないため、接着細菌細胞の計数が可能です。組織培養培地の容量を1 mLに減らして(浸潤および細胞内複製アッセイでは2 mL)、細菌とHT-29細胞とのより効率的な接触を可能にします。さらに、付着率によっては、3時間のインキュベーション中に浸潤および細胞内複製が起こり得るが、その量は通常無視できる(例えば、宿主細胞溶解後に回収された細菌集団のわずか0.05%)。それにもかかわらず、3時間のインキュベーション中に付着細菌と細胞内細菌を適切に考慮するために、記載されたプロトコルに加えて、2番目のプレートを50 μg/mLのゲンタマイシンとウェルあたり2 mLのDMEMで合計45分間インキュベート(15分間のインキュベーション、洗浄、新鮮なDMEM +ゲンタマイシンを30分間)インキュベートして、細胞外細菌を完全に溶解するパラレルアッセイを実施することをお勧めします。プロトコルに記載されているHT-29細胞溶解に続いて、細胞内細菌は上記のように列挙することができ、侵入した細菌の数を表します。次に、ゲンタマイシン処理なしでプレートから列挙された細菌からこの値を差し引いて、付着細菌と侵入細菌を適切に決定できます。また、浸潤後のHT-29細胞内の赤痢菌の細胞内複製について、例えば、複数の時点を用いて細胞内増殖曲線を解析するなど、より深い洞察を得るために、並行解析を実施することもできる。最後に、18時間のゲンタマイシンインキュベーション後の細胞内細菌の列挙とともに、培養上清を採取し、感染したHT-29細胞のサイトカイン分泌について分析することができます。例えば、IL-8は上皮細胞から分泌されるケモカインであり、主にPMNを感染部位に動員する働きをします。感染したHT-29細胞の培地に分泌されるIL-8の量は、IL-8 ELISAアッセイ67で分析することができる。
胆汁塩は、ヒト消化管系を通過する際の赤痢菌の重要な病原性シグナルであることが証明されており、これらのプロトコルで細菌増殖培地を補い、典型的な消化管状態を再現するために使用できます。当然のことながら、胆汁塩は消化を助けるために十二指腸または小腸の上部に導入されます。そして回腸末端または小腸の末端では、胆汁塩の95%が除去され、胆嚢に最終的に沈着するために循環に戻される68。胆汁塩は通常、小腸で0.2%〜2.0%(w / v)の濃度を持ち、自然に殺菌性があります。しかし、赤痢菌は、ほとんどの腸内細菌とともに胆汁塩に抵抗し、そのシグナルを利用して感染を増強する47。いくつかの研究は、胆汁塩への曝露が、時にはグルコースなどの他の小腸信号と連動して、感染前の赤痢菌の生存と病原性調節にどのように影響するかを文書化しています。赤痢菌は、胆汁塩に抵抗し、遺伝子発現を変化させ、小腸輸送を再現する条件でバイオフィルムを形成して分散させることが示されています17,69。研究は、これらの変化が高毒性の表現型をもたらし、赤痢菌によるその後の結腸感染時に付着と浸潤が誘発されることを実証しました17,18,19,48,66。したがって、上記で概説した条件は、接着、浸潤、または細胞内複製アッセイを実行する前に、小腸通過を模倣するために胆汁塩で赤痢菌を継代培養する方法を文書化しています。指定されたTSB製剤には、典型的なルリアブロス(LB)17と比較してグルコースが添加されています。したがって、LBを用いる場合、小腸17におけるグルコースシグナルを適切に考慮するために、培地にグルコース(0.5%-2.0%[w/v])を補給することも重要である。さらに、前述したように、すべての赤痢菌の継代培養物は洗浄して胆汁塩を除去し、感染分析のために結腸への移行を模倣します。
従来、上記の結果(図1および図2)で強調されているように、感染アッセイは赤痢菌感染における特定の遺伝子の役割を決定するために有用です。しかし、さまざまな変異体の表現型は、細菌培養培地の適切な補給なしには真に評価されない可能性があります。先行研究で実証されているように、胆汁塩は、中枢代謝の遺伝子、転写因子、糖トランスポーター、薬剤耐性、染色体または病原性プラスミドにコードされている病原性遺伝子など、S. flexneri遺伝子の発現を有意に変化させる17。これらの遺伝子は、赤痢菌が胆汁塩をシグナルとして使用して遺伝子発現を変化させ、結腸の最終的な感染に備える方法に関する洞察を提供し、したがって、アドヒアランス、浸潤、および細胞内複製アッセイにおける病原性への影響を調べる前に、適切な補充された細菌増殖培地でその後の突然変異分析を実施する必要があります。上記の図1および図2に見られるように、ΔVF変異はアドヒアランスには影響しなかったが、浸潤および細胞内複製には影響を与えた。この変異により細胞内浸潤と細胞内複製が促進されるため、現在、遺伝子産物がどのように感染を制御しているかを明らかにする実験が進行中です。変異体解析は、赤痢菌の病因に関する新しい理解を、特にヒト消化管をよりよく再現する条件で研究する方法の一例として役立ちます。さまざまな変異体の表現型を検証するために、適切な相補分析が推奨されます。
組み合わせて、これらの手順は、感染中のヒト消化管の自然環境を最もよく模倣することにより、赤 痢菌 の付着、HT-29結腸上皮細胞への浸潤、および複製の分子メカニズムに関する重要な洞察を提供する定量的実験を記述します。今後の研究では、 赤痢菌 がヒト宿主に対してどのように準備し、効果的に感染するかについての理解を深めるために、変異体と実験条件を拡張することができます。何十年にもわたる研究にもかかわらず、 赤痢菌 感染症についてはまだまだ多くの発見があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者への支援には、マサチューセッツ総合病院の小児科、研究暫定支援資金(ISF)に関する執行委員会賞2022A009041、国立アレルギー感染症研究所の助成金R21AI146405、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の助成金ハーバード大学栄養肥満研究センター(NORCH)2P30DK040561-26が含まれる。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PES filter | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media |
| 14 mL culture tubes | Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap |
| 6-well tissue culture plates | Corning | 3516 | Plates are treated for optimal cell attachment |
| Bile salts | Sigma-Aldrich | B8756 | 1:1 ratio of cholate to deoxycholate |
| Congo red dye | Sigma-Aldrich | C6277 | A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity |
| Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | To be used with the Countess Automated Cell Counter |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | A a highly polar organic reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat-inactivated, sterile |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G3632 | Stock concentration is 50 mg/mL |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin |
| Paraffin film | Bemis | PM999 | Laboratory sealing film |
| Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1x concentration; pH 7.4 |
| Select agar | Invitrogen | 30391023 | A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media |
| T75 flasks | Corning | 430641U | Tissue culture flasks |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | A common non-ionic surfactant and emulsifier |
| Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Bacterial growth media |
References
- Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
- WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
- Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
- Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
- Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
- Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
- Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
- Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
- Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
- Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
- Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
- Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
- WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
- DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
- Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
- Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
- Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
- Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
- Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
- Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
- Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
- Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
- Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
- Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
- Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
- West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
- Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
- Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
- Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
- Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M.
- Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
- Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
- Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
- Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
- Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
- Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
- NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
- Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A.
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
- Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
- Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
- Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
- Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J.
- Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
- Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
- Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
- Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
- Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
- Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
- Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
- Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
- Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
- Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).
