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Immunology and Infection

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

Abstract

인간이 적응한 장내 세균 병원균 Shigella는 매년 수백만 건의 감염을 일으키고, 소아 환자들 사이에서 장기적인 성장 효과를 일으키며, 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인입니다. 감염은 병원체가 위장관을 통과하여 결장 내벽의 상피 세포를 감염시킨 결과로 물이나 피가 섞인 설사를 유발합니다. 항생제 내성이 급격히 증가하고 현재 승인된 백신이 부족하기 때문에 이 무시무시한 병원체를 연구하기 위해서는 표준화된 연구 프로토콜이 매우 중요합니다. 여기에서는 결장 상피 세포에서 박테리아 부착, 침습 및 세포 내 복제에 대한 시험관 내 분석을 사용하여 Shigella의 분자 발병 기전을 조사하는 방법론을 제시합니다. 감염 분석 이전에, Shigella 군집의 독성 표현형은 한천 플레이트에서 콩고 적색 염료의 흡수에 의해 확인되었습니다. 보충된 실험실 배지는 in vivo 조건을 모방하기 위해 박테리아 배양 중에 고려할 수도 있습니다. 그런 다음 박테리아 세포는 표준화된 프로토콜에서 조직 배양 플레이트의 결장 상피 세포를 확립된 다중성 감염에서 감염시키고 각 감염 단계를 분석하기 위한 적응을 통해 사용합니다. 부착 분석의 경우, Shigella 세포는 상피 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하기 위해 감소된 배지 수준으로 배양됩니다. 침습 및 세포 내 복제 분석 모두에서 겐타마이신은 세포 외 박테리아를 제거하고 침입 평가 및/또는 세포 내 복제 속도의 정량화를 가능하게 하기 위해 다양한 시간 간격으로 적용됩니다. 모든 감염 프로토콜은 감염된 상피 세포 용해물을 연속적으로 희석하고 콩고 적색 한천 플레이트의 감염 역가와 관련된 박테리아 콜로니 형성 단위를 도금하여 부착, 침입 및/또는 세포 내 박테리아를 열거합니다. 이러한 프로토콜은 상피 세포의 이질균 감염의 각 단계에 대한 독립적인 특성 분석 및 비교를 통해 이 병원체를 성공적으로 연구할 수 있습니다.

Introduction

장내 세균성 병원체로 인한 설사병은 전 세계적으로 심각한 건강 부담입니다. 2016년 설사병은 전 세계적으로 130만 명의 사망을 초래했으며 1,2세 미만 5세 미만 어린이의 사망 원인 중 4위를 차지했습니다. 그람 음성, 장 세균성 병원균 Shigella는 전 세계적으로 설사로 인한 사망의 주요 원인인 이질증의 원인균입니다3. 이질균은 저소득 및 중간소득 국가의 아동에서 매년 상당한 이환율과 사망률을 유발하며4,5 고소득 국가의 감염은 탁아소, 식품 매개 및 수인성 발병과 관련이 있습니다6,7,8,9. 비효율적인 백신 개발10 및 항생제 내성(AMR)11,12 증가로 인해 대규모 이질균 발병 관리가 복잡해졌습니다. 미국 질병통제예방센터(Centers for Disease Control and Prevention)의 최근 자료에 따르면 2020년 미국 내 이질균 감염의 약 46%가 약물 내성을 보였으며13,14 세계보건기구(WHO)는 시겔라를 새로운 치료법이 시급히 필요한 항생제 내성 우선 병원체로 선언했다15.

이질균 감염은 오염된 음식이나 물을 섭취할 때 분변-경구 경로를 통해 또는 직접적인 인체 접촉을 통해 쉽게 전염됩니다. Shigella는 질병을 일으키기에 충분한 10-100개의 박테리아를 가진 효율적이고 인간에 적응한 병원체로 진화했습니다16. 소장 이동 중에 Shigella는 체온 상승 및 담즙과 같은 환경 신호에 노출됩니다17. 이러한 신호의 검출은 인간 결장을 감염시키는 박테리아의 능력을 향상시키는 독성 인자를 발현하기 위해 전사 변화를 유도합니다 17,18,19. Shigella는 정점 표면에서 결장 상피를 침범하지 않고 오히려 소낭 관련 상피20,21,22 내의 특수 항원 제시 마이크로 폴드 세포 (M 세포)로 흡수 된 후 상피 층을 가로 질러 이동합니다. transcytosis에 이어, Shigella 세포는 상주 대식세포에 의해 phagocytosed됩니다. Shigella는 식체를 빠르게 탈출하고 대식세포 세포 사멸을 유발하여 전염증성 사이토카인 5,23,24를 방출합니다. 그런 다음 Shigella는 기저측에서 결장 상피 세포에 침입하여 macropinocytic 액포를 용해시키고 세포질 5,25에 복제 틈새를 설정합니다. 전염증성 사이토카인, 특히 인터루킨-8(IL-8)은 다형핵 호중구 백혈구(PMN)를 감염 부위에 모집하여 상피의 단단한 접합부를 약화시키고 상피 내벽의 박테리아 침투를 가능하게 하여 기저외측 감염을 악화시킨다5. PMN은 감염된 상피 내벽을 파괴하여 감염을 억제하며, 이는 세균성(혈성) 이질의 특징적인 증상을 초래한다5. 침습 및 세포 내 복제 메커니즘이 철저하게 규명되었지만, 새로운 연구는 위장관 (GI) 통과 중 독성 조절17, 순응19, 장벽 투과성을 통한 기저측 접근 개선26 및 영양실조 아동27의 무증상 보균을 포함하여 이질균 감염에 대한 중요한 새로운 개념을 입증하고 있습니다.

설사병을 유발하는 Shigella spp.의 능력은 인간과 비인간 영장류(NHP)로 제한됩니다(NHP)28. Shigella 장 감염 모델은 제브라피시29, 마우스30, 기니피그31, 토끼 21,32,33 및 돼지34,35에 대해 개발되었습니다. 그러나, 이들 모델 시스템 중 어느 것도 인간 감염 중에 관찰된 질병 특성을 정확하게 복제할 수 없다36. 이질균의 NHP 모델은 이질균 발병 기전을 연구하기 위해 확립되었지만, 이러한 모델 시스템은 구현하는 데 비용이 많이 들고 인간의 감염 선량보다 최대 9배나 높은 인위적으로 높은 감염 선량을 필요로 합니다 37,38,39,40,41,42. 따라서 인간 숙주의 감염에 대한 Shigella의 놀라운 적응은 Shigella 발병 기전의 정확한 조사를 위해 생리학적으로 관련된 모델을 재현하기 위해 인간 유래 세포 배양을 사용해야 합니다.

여기에서는 HT-29 결장 상피 세포 내에서 Shigella 부착률, 침습 및 복제율을 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이러한 표준화된 프로토콜을 사용하여 박테리아 독성 유전자와 환경 신호가 Shigella 감염의 각 단계에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 조사하여 동적 숙주-병원체 상호 작용 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다.

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Protocol

1. 시약 및 재료의 준비

참고: 모든 부피는 두 개의 6웰 플레이트를 사용한 분석과 일치합니다.

  1. TSB 배지: 트립틱 대두 육수(TSB, 재료 표 참조) 배지 0.5g에 탈이온수(DI) 15L를 넣고 오토클레이브합니다. 실온에서 보관하십시오.
  2. 담즙염 배지(TSB + BS): 0.4%(w/v)의 담즙염을 함유하는 TSB를 제조하기 위해, 0.06g의 담즙염(BS, 재료표 참조)을 오토클레이브 TSB 15mL에 재현탁시킵니다. 0.22μm PES 필터를 사용하여 필터를 멸균합니다.
    참고: 담즙염은 콜산나트륨과 데옥시콜산나트륨의 1:1 혼합물로 구성됩니다. 사용하기 직전에 새 용지를 준비하십시오.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 45mL에 소 태아 혈청(FBS) 5mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  4. DMEM + 겐타마이신: 50mL 튜브에 DMEM 50mL와 겐타마이신 50μL를 추가합니다( 재료 표 참조).
    참고: 신선한 부분 표본을 만들고 각 실험 전에 37°C 수조에서 따뜻하게 합니다.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: 150 μL의 Triton X-100을 15 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 첨가합니다.
    참고: 신선한 부분 표본을 만들고 각 실험 전에 37°C 수조에서 따뜻하게 합니다.
  6. TSB + 콩고 적색 표시판: 15L 병에 TSB 15g, 일부 한천 7.5g, 콩고 적색 염료 0.125g( 재료 표 참조)을 추가합니다. 탈이온수 0.5L를 넣고 오토클레이브를 넣습니다. 10-20mL의 배지를 개별 멸균 페트리 접시(100mm x 15mm)에 붓고 응고시킵니다.
    주의: 콩고 레드는 발암 물질이며 생식 독성 물질입니다. 콩고 레드의 취급은 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행되어야 합니다. 자세한 내용은 제품 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
    참고: 약 20개의 플레이트가 0.5L 콩고 레드 미디어로 만들어집니다. 플레이트는 2-3일 전에 미리 준비할 수 있으며 사용할 때까지 실온에서 거꾸로 둘 수 있습니다. 장기 보관을 위해 거꾸로 된 플레이트를 4°C의 플라스틱 슬리브에 최대 3개월 동안 보관하십시오.
  7. DMEM + 10% (v/v) FBS 및 5% (v/v) 디메틸 설폭사이드(DMSO): 50mL 튜브에 DMEM 42.5mL, FBS 5mL 및 DMSO 2.5mL를 추가합니다. 4 °C에서 보관하십시오.

2. 박테리아의 준비

참고: 모든 Shigella 실험실 재배 및 보관 프로토콜은 Payne, SM 43에서 채택되었습니다.

주의: Shigella spp.는 위험 그룹 2 병원체44입니다. BSL-2 환경에서 모든 실험실 작업을 수행하고, Shigella spp의 낮은 감염률로 인한 우발적 노출을 제한하기 위해 추가 안전 조치를 취합니다.

  1. 냉동 재고에서 Shigella 의 성장
    1. 멸균 어플리케이터를 사용하여 극저온 바이알에서 TSB + Congo 적색 한천 플레이트로 소량의 냉동 배양물을 옮깁니다.
    2. 접종 루프를 화염 살균하고 식히십시오. 플레이트의 한 사분면을 가로질러 앞뒤로 줄무늬 접종. 루프에 불을 붙이고 식힌 다음 첫 번째 사분면에서 플레이트의 두 번째 사분면으로 줄무늬를 그립니다. 플레이트의 세 번째 및 네 번째 사분면에 접종물을 줄무늬로 만들기 위해 반복합니다.
      알림: 또는 각 사분면 사이에 새로운 멸균 어플리케이터를 사용하여 접종물을 줄무늬로 만듭니다.
    3. 플레이트를 뒤집고 37°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: ≥37°C의 온도에서 배양은 콩고 적색 양성(CR+) 표현형45의 관찰에 필요한 Shigella 독성 인자의 발현에 필요합니다. 무독성 군집은 흰색으로 보이며 침습적이지 않습니다.
    4. 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 냉장 보관합니다.
      참고: 박테리아 콜로니는 1-2주 동안 한천 플레이트에서 생존할 수 있습니다.
  2. 액체 배양에서 Shigella 의 하룻밤 성장
    1. 3mL의 TSB 배지를 멸균 14mL 배양 튜브에 분취합니다.
    2. 멸균 어플리케이터를 사용하여 잘 분리된 단일 적색(CR+) 콜로니를 선택하고 액체 배지에 재현탁합니다.
    3. 37°C에서 분당 250회전(rpm)으로 진탕하여 밤새(16-18시간) 배양액을 배양합니다.

3. HT-29 진핵 세포의 제조

참고: 모든 부피는 두 개의 6웰 플레이트를 사용한 분석과 일치합니다. HT-29 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 획득했습니다. HT-29 유지보수 프로토콜은 ATCC 권장 사항46에서 조정됩니다. 모든 매체는 사용하기 전에 37°C의 수조에서 미리 데워야 합니다. 모든 HT-29 유지보수 프로토콜은 생물안전 작업대에서 수행해야 합니다. pH의 급격한 변화를 피하기 위해 배지에서 HT-29 세포를 혼합/작업할 때 기포 생성을 삼가십시오.

  1. 냉동 육수에서 HT-29 세포 해동
    1. HT-29 세포 바이알을 37°C 수조에서 해동합니다.
      알림: 오염을 방지하기 위해 캡이 물 위에 완전히 있는지 확인하십시오. 해동하는 데 2분 미만이 소요됩니다.
    2. 배양액이 완전히 해동된 직후 물에서 바이알을 제거하고 70% 에탄올로 오염을 제거합니다. 이 시점의 모든 단계가 무균 기술을 사용하여 수행되는지 확인하십시오.
    3. 바이알의 모든 내용물을 9mL DMEM + 10% FBS가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 실온에서 125 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    4. 상층액을 폐기물 용기에 디캔팅하고 펠릿을 10mL의 따뜻한 DMEM + 10% FBS에 재현탁시킵니다. 재현탁 세포를 10mL의 따뜻한 DMEM + 10% FBS(총 부피 20mL)가 들어 있는 75cm2 조직 배양 플라스크(T75)로 옮깁니다.
    5. 세포가 90 % 밀도에 도달 할 때까지 5 % CO2 (약 6-7 일)로 37 ° C에서 세포를 배양합니다.
      참고: 밀도는 시각적 근사치를 통해 추정됩니다.
  2. HT-29 세포 파종
    1. 37°C 수조에서 PBS 20mL와 DMEM + 10% FBS 50mL를 예열하고 3mL의 0.25%(w/v) Trypsin-EDTA를 실온으로 예열합니다.
    2. HT-29 세포(3.1단계)가 90% 밀도에 도달하면 T75 플라스크에서 HT-29 세포 배양 배지를 폐기물 용기로 디캔팅합니다. ~10mL의 따뜻한 PBS를 플라스크에 붓고 부드럽게 휘저어 세척합니다. PBS를 폐기물 용기에 디캔팅합니다. 따뜻한 PBS로 다시 씻고 디캔팅합니다.
    3. 0.25%(w/v) Trypsin-EDTA를 2-3mL 첨가하고 전체 표면적을 따라 부드럽게 휘젓습니다. 37 °C에서 5 % CO2 로 4 분 동안 배양합니다.
    4. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내고 Trypsin-EDTA를 부드럽게 휘저어 모든 세포가 표면에서 분리되도록 육안으로 확인합니다.
    5. 즉시 6mL의 따뜻한 DMEM + 10% FBS를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 피펫을 위아래로 움직여 완전히 섞습니다.
    6. 모든 내용물을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 500 x g 으로 회전시킵니다.
    7. 상층액을 폐기물 용기에 부드럽게 디캔팅하고 펠릿을 6mL의 따뜻한 DMEM + 10% FBS에 재현탁시킵니다.
    8. 재현탁 직후 배양 중간에서 10μL의 부유 HT-29 세포를 0.2mL PCR 튜브로 옮깁니다. PCR 튜브에 10μL의 Trypan blue 염료를 넣고 혼합합니다.
    9. 10μL의 HT-29 세포/트리판 블루 혼합물을 일회용 Countess 세포 카운터 챔버 슬라이드에 추가합니다( 재료 표 참조). 살아있는 세포의 수를 열거하고 세포 생존율을 계산합니다.
      알림: 샘플의 셀 수를 문서화할 때 총 셀 수가 아닌 "살아있는" 셀 수 아래의 숫자를 읽으십시오. 또는 혈구분석기를 사용하여 세포 계수를 수동으로 수행할 수 있습니다.
    10. 재현탁된 HT-29 세포를 새로운 T75 플라스크 또는 6웰 플레이트에 시드합니다.
      1. T75 플라스크의 경우:
        1. 피펫으로 부드럽게 혼합한 다음 아래 방정식에 따라 2.5 x 106 세포를 새 T75 플라스크에 옮깁니다.
          Equation 1
        2. 따뜻한 DMEM + 10% FBS 배지를 최종 부피 20mL(최종 농도 1.25 x 105 cells/mL)에 추가합니다.
        3. 앞뒤로 부드럽게 흔들어 플라스크 전체에 세포를 고르게 분산시킵니다.
        4. 세포가 80% 밀도에 도달할 때까지 5%CO2 로 37°C에서 배양합니다.
          알림: 최적의 성장을 위해 T10 플라스크의 DMEM + 75% FBS 미디어를 ~3일마다 교체하십시오. 배지를 폐기물 용기에 디캔팅하고 플라스크에 따뜻한 PBS 10mL를 추가합니다. PBS를 부드럽게 휘젓고 쓰레기통에 디캔팅합니다. 그런 다음 플라스크에 신선하고 따뜻한 DMEM + 10% FBS 20mL를 넣고 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 돌아갑니다.
      2. 6웰 플레이트의 경우:
        1. 피펫으로 부드럽게 혼합한 다음 아래 방정식에 따라 5.85 x 106 세포를 새로운 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
          Equation 2
        2. 따뜻한 DMEM + 10% FBS 배지를 최종 부피 26mL(최종 농도 2.25 x 105 cells/mL)에 추가합니다.
        3. 피펫으로 부드럽게 혼합한 다음 2mL(4.5 x 105 세포)를 6웰 플레이트의 개별 웰에 분주합니다.
        4. 위/아래 및 왼쪽/오른쪽 2-3x를 부드럽게 흔들어 웰 전체에 세포를 고르게 분산시킵니다.
        5. 세포가 80 % -95 % 밀도에 도달 할 때까지 5 % CO2 (약 37-4 일)로 37 ° C에서 배양합니다.
          참고: 85% 밀도는 침습 및 세포 내 복제 분석에 권장되며, 90%-95% 밀도는 부착 분석에 권장됩니다. 세포는 약 85 x 1 x 106 cells/well의 최종 농도로 48시간 배양 후 ~6% 밀도에 도달해야 합니다. 파종된 세포의 수와 배양 기간에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
  3. 냉동 HT-29 재고 만들기
    1. 1mL의 DMEM + 10% FBS + 5% DMSO 배지를 개별 극저온 바이알에 분취합니다.
    2. 3.2.7단계의 1 x 106 HT-29 세포를 각 바이알에 추가합니다. 아래 공식에 따라 셀의 부피를 계산하십시오.
      Equation 3
    3. HT-29 셀은 -130 °C 이하에서 액체 질소 증기 저장 냉동고에 장기간 보관하십시오.

4. 접착 분석

참고: 모든 부피는 두 개의 6웰 플레이트를 사용한 분석과 일치합니다.

  1. 하룻밤 사이에 시겔라 배양을 1:50 희석 하여 신선한 배지로 하위배양합니다.
    1. Vortex를 사용한 다음 적절한 크기의 배양 튜브에 있는 5mL의 신선한 TSB 또는 TSB + BS에 각 하룻밤 배양액 100μL를 추가합니다.
      알림: 적절한 통기를 위해 배양 부피를 배양 플라스크 또는 튜브 부피의 <20%로 제한하십시오.
    2. 세포가 0.7(Shigella 성장의 중간 로그 단계)의 광학 밀도(OD600)에 도달할 때까지 250rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양합니다. 약 2-2.5시간
      참고: 하위 배양 중에 모든 세척 단계에 대해 50mL의 DMEM과 충분한 양의 PBS를 분취하여 37°C 수조에 넣습니다. 사용하기 전에 매체가 37°C에 도달하도록 하십시오.
  2. 2 x 108 콜로니 형성 단위(CFU) 시 겔라 하위 배양을 개별 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    참고: 2 x 108 CFU는 OD600 0.7에서 약 1mL의 박테리아 세포에 해당합니다. OD600 판독값을 사용하여 각 개별 분광 광도계의 교정에 따라 CFU/mL를 근사화합니다.
  3. 각 Shigella 샘플을 PBS로 2번 세척합니다.
    1. 실온에서 17,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 펠릿 셀. 상층액을 흡인한 다음 따뜻한 PBS 1mL를 추가하고 펠릿을 잘 재현탁하여 혼합물이 완전히 균질해질 때까지(8-10배) 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
    2. 4.3.1 단계를 1회 더 반복합니다.
    3. 실온에서 2분 동안 17,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿하고, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 2mL의 따뜻한 DMEM에 재현탁시킵니다.
      알림: 재현탁 박테리아의 최종 농도는 1 x 108 CFU/mL입니다.
  4. Vortex, 그런 다음 1mL(1 x10 8CFU )의 재현탁 Shigella 를 6웰 플레이트에서 준비된 HT-29 결장 상피 단층의 각 웰에 추가합니다(단계 3.2.10.2에서).
    참고: 감염은 일반적으로 100의 다중 감염(MOI, 박테리아 대 상피 세포의 비율)에서 수행됩니다. 다른 MOI를 테스트하려면 따뜻한 DMEM에서 재현탁 Shigella 를 원하는 농도로 희석한 다음 희석된 박테리아 1mL를 HT-29 단층에 추가합니다. 예를 들어, MOI 10을 테스트하려면 1 x 108 CFU/mL 박테리아 150μL를 따뜻한 DMEM 1.35mL에 첨가하여 박테리아를 1:10으로 희석한 다음 HT-29 세포에 1mL(1 x 107CFU )를 적용합니다.
  5. 37 °C에서 5 % CO2 로 3 시간 동안 6 웰 플레이트를 배양합니다.
  6. 배양 중에 박테리아 감염 역가를 결정합니다.
    1. 재현탁된 Shigella 세포의 10배 연속 희석액(4.3.3단계에서)을 PBS로 준비합니다.
    2. 1 x 10-5 및 1 x 10-6 희석액을 100μL의 TSB + 콩고 레드 플레이트에 담아 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 1 x 10-5 및 1 x 10-6 희석액에서 100μL를 도금하면 각각 1 x 10-6 및 1 x 10-7의 최종 희석 계수에 해당합니다.
  7. 배양 후 PBS로 단층을 4-5x 세척합니다.
    1. 각 우물에서 매체를 흡입합니다.
      알림: 6웰 플레이트에서 매체를 흡입할 때 HT-29 셀과의 접촉을 피하면서 웰의 바닥면을 따라 흡입기 팁을 안내합니다.
    2. 각 웰에 따뜻한 PBS 1mL를 넣고 부드럽게 씻습니다.
      알림: PBS로 6웰 단층을 부드럽게 세척하려면 벤치탑에서 플레이트를 위아래로 좌우로 움직입니다. 플레이트를 원을 그리며 세척하거나 벤치탑 표면에서 플레이트를 제거하면 플라스틱에서 셀이 기계적으로 제거될 수 있습니다.
    3. 4.7.1단계와 4.7.2단계를 추가로 4번 반복합니다.
  8. 흡인으로 PBS를 제거하고 각 웰에 1mL의 PBS + 1% Triton X-100을 추가하여 HT-29 세포를 용해합니다.
  9. 6웰 플레이트를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  10. 세포 스크레이퍼 또는 구부러진 피펫 팁을 사용하여 웰 바닥에서 용해된 세포를 긁어내고 전체 1mL를 새 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  11. 세포 관련 박테리아의 수를 결정합니다.
    1. 용해된 진핵 세포에서 Shigella 를 추가로 치환하기 위해 각 튜브(4.10단계에서)를 최소 30초 동안 소용돌이칩니다.
    2. 용해물을 PBS로 10배 연속 희석하여 준비합니다.
    3. 1 x 10-2, 1 x 10-3 및 1 x 10-4 희석액을 100μL의 TSB + 콩고 레드 플레이트에 담아 37°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 1 x 10-2, 1 x 10-3 및 1 x 10-4 희석액에서 100μL를 도금하면 각각 1 x 10-3, 1 x 10-4 및 1 x 10-5의 최종 희석 계수에 해당합니다.

5. 침습 분석

참고: 모든 부피는 두 개의 6웰 플레이트를 사용한 분석과 일치합니다.

  1. 하룻밤 사이에 시겔라 배양을 1:50 희석 하여 신선한 배지로 하위배양합니다.
    1. Vortex를 사용한 다음 적절한 크기의 배양 튜브에 있는 5mL의 신선한 TSB 또는 TSB + BS에 각 하룻밤 배양액 100μL를 추가합니다.
      알림: 적절한 통기를 위해 배양 부피를 배양 플라스크 또는 튜브 부피의 <20%로 제한하십시오.
    2. 세포가 0.7의 OD600 ( Shigella 성장의 중간 로그 단계)에 도달할 때까지 250rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양합니다. 약 2-2.5시간
      참고: 하위 배양 중에 모든 세척 단계에 대해 50mL의 DMEM + 50mg/mL 겐타마이신과 충분한 양의 PBS를 분취하여 37°C 수조에 넣습니다. 사용하기 전에 매체가 37°C에 도달하도록 하십시오.
  2. 2 x 108 CFU 하위 배양된 Shigella 를 개별 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
    참고: 2 x 108 CFU는 OD600 0.7에서 약 1mL의 박테리아 세포에 해당합니다. OD600 판독값을 사용하여 각 개별 분광 광도계의 교정에 따라 CFU/mL를 근사화합니다.
  3. PBS로 Shigella 샘플을 1회 세척합니다.
    1. 실온에서 17,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 펠릿 셀. 상층액을 흡인한 다음 따뜻한 PBS 1mL를 추가하고 펠릿을 잘 재현탁하여 혼합물이 완전히 균질해질 때까지(8-10배) 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
    2. 5.3.1단계를 반복합니다. 추가 시간이 1배 증가합니다.
    3. 실온에서 2분 동안 17,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿하고, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 2mL의 따뜻한 DMEM에 재현탁시킵니다.
      알림: 재현탁 박테리아의 최종 농도는 1 x 108 CFU/mL입니다.
  4. Vortex를 사용한 다음, 1 mL의 재현탁 Shigella와 1 mL의 DMEM을 6-웰 플레이트에서 준비된 HT-29 결장 상피 단층의 각 웰에 추가합니다(단계 3.2.10.2).
    참고: 감염은 일반적으로 100의 다중 감염(MOI, 박테리아 대 상피 세포의 비율)에서 수행됩니다. 다른 MOI를 테스트하려면 DMEM의 재현탁 Shigella 를 원하는 농도로 희석한 다음 희석된 박테리아 1mL를 HT-29 단층에 추가합니다. 예를 들어, 10의 MOI를 테스트하려면 150μL의 1 x 108 CFU/mL 박테리아를 1.35mL의 DMEM에 추가하여 박테리아를 1:10으로 희석한 다음 HT-29 세포에 1mL(1 x 107CFU )를 추가합니다.
  5. HT-29 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하려면 6웰 플레이트를 실온에서 10분 동안 2,000 x g 에서 원심분리하거나 온도 설정을 조정할 수 있는 경우 37°C에서 원심분리합니다.
    알림: 원심분리는 HT-29 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하여 부착 인자의 필요성을 우회하고 박테리아가 세포에 빠르게 침입할 수 있도록 합니다.
  6. 37°C에서 5% CO2 로 45분 동안 6웰 플레이트를 배양합니다.
  7. 배양 중에 박테리아 감염 역가를 결정합니다.
    1. 재현탁 Shigella 세포의 10배 연속 희석액(5.3.3단계에서)을 PBS로 준비합니다.
    2. 1 x 10-5 및 1 x 10-6 희석액을 100μL의 TSB + 콩고 레드 플레이트에 담아 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 1 x 10-5 및 1 x 10-6 희석액에서 100μL를 도금하면 각각 1 x 10-6 및 1 x 10-7의 최종 희석 계수에 해당합니다.
  8. 감염된 HT-29 세포를 PBS 1mL로 3회 철저히 세척합니다.
    1. 각 우물에서 매체를 흡입합니다.
      알림: 6웰 플레이트에서 매체를 흡입할 때 HT-29 셀과의 접촉을 피하면서 웰의 바닥면을 따라 흡입기 팁을 안내합니다.
    2. 각 웰에 따뜻한 PBS 1mL를 넣고 부드럽게 씻습니다.
      알림: PBS로 6웰 단층을 부드럽게 세척하려면 벤치탑에서 플레이트를 위아래로 좌우로 움직입니다. 플레이트를 원을 그리며 세척하거나 벤치탑 표면에서 플레이트를 제거하면 플라스틱에서 셀이 기계적으로 제거될 수 있습니다.
    3. 5.8.1단계와 5.8.2단계를 추가로 2번 반복합니다.
  9. 흡인으로 PBS를 제거한 다음 50μg/mL 겐타마이신이 보충된 따뜻한 DMEM 2mL를 각 웰에 추가하고 5%CO2로 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  10. 감염된 HT-29 세포를 PBS 1mL로 3회 철저히 세척합니다.
    1. 세탁 단계 5.8을 반복합니다.
  11. 흡인으로 PBS를 제거한 다음 50μg/mL 겐타마이신이 보충된 따뜻한 DMEM 2mL를 각 웰에 추가하고 5%CO2로 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
  12. 감염된 HT-29 세포를 PBS 1mL로 3회 철저히 세척합니다.
    1. 세탁 단계 5.8을 반복합니다.
  13. 흡인으로 PBS를 제거하고 각 웰에 1mL의 PBS + 1% Triton X-100을 추가하여 HT-29 세포를 용해합니다.
  14. 6웰 플레이트를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  15. 세포 스크레이퍼 또는 구부러진 피펫 팁을 사용하여 웰 바닥에서 용해된 세포를 긁어내고 전체 1mL를 새 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  16. 세포 내 박테리아의 수를 결정합니다.
    1. 용해된 진핵 세포에서 Shigella 를 추가로 치환하기 위해 각 튜브(단계 5.15에서)를 최소 30초 동안 소용돌이칩니다.
    2. 용해물을 PBS로 10배 연속 희석하여 준비합니다.
    3. 1 x 10-2 및 1 x 10-3 희석액을 100 μL의 TSB + 콩고 레드 플레이트에 담아 37°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 1 x 10-2 및 1 x 10-3 희석액에서 100μL를 도금하면 각각 1 x 10-3 및 1 x 10-4의 최종 희석 계수에 해당합니다.

6. 세포내 복제 분석

참고: 모든 부피는 두 개의 6웰 플레이트를 사용한 분석과 일치합니다.

  1. 하룻밤 사이에 시겔라 배양을 1:50 희석 하여 신선한 배지로 하위배양합니다.
    1. Vortex를 사용한 다음 적절한 크기의 배양 튜브에 있는 5mL의 신선한 TSB 또는 TSB + BS에 각 하룻밤 배양액 100μL를 추가합니다.
      알림: 적절한 통기를 위해 배양 부피를 배양 플라스크 또는 튜브 부피의 <20%로 제한하십시오.
    2. 세포가 0.7의 OD600 ( Shigella 성장의 중간 로그 단계)에 도달할 때까지 250rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양합니다. 약 2-2.5시간
      참고: 하위 배양 중에 모든 세척 단계에 대해 50mL의 DMEM + 50mg/mL 겐타마이신과 충분한 양의 PBS를 분취하여 37°C 수조에 넣습니다. 사용하기 전에 매체가 37°C에 도달하도록 하십시오.
  2. 2 x 108 CFU 하위 배양된 Shigella 를 개별 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
    참고: 2 x 108 CFU는 OD600 0.7에서 약 1mL의 박테리아 세포에 해당합니다. OD600 판독값을 사용하여 각 개별 분광 광도계의 교정에 따라 CFU/mL를 근사화합니다.
  3. PBS로 Shigella 샘플을 1회 세척합니다.
    1. 실온에서 17,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 펠릿 셀. 상층액을 흡인한 다음 따뜻한 PBS 1mL를 추가하고 펠릿을 잘 재현탁하여 혼합물이 완전히 균질해질 때까지(8-10배) 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
    2. 6.3.1단계를 반복합니다. 추가 시간이 1배 증가합니다.
    3. 실온에서 2분 동안 17,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 펠릿하고, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 2mL의 따뜻한 DMEM에 재현탁시킵니다.
      알림: 재현탁 박테리아의 최종 농도는 1 x 108 CFU/mL입니다.
  4. Vortex를 사용한 다음, 1-웰 플레이트에서 준비된 HT-29 결장 상피 단층의 각 웰에 재현탁 Shigella 1mL(1 x10 8CFU)와 DMEM 1mL를 추가합니다(3.2.10.2단계에서).
    참고: 감염은 일반적으로 100의 다중 감염(MOI, 박테리아 대 상피 세포의 비율)에서 수행됩니다. 다른 MOI를 테스트하려면 DMEM의 재현탁 Shigella 를 원하는 농도로 희석한 다음 희석된 박테리아 1mL를 HT-29 단층에 추가합니다. 예를 들어, 10의 MOI를 테스트하려면 1.35mL의 DMEM에 1 x 108 CFU/mL 박테리아 150μL를 첨가하여 박테리아를 1:10으로 희석한 다음 HT-29 세포에 1mL(1 x 107CFU )를 적용합니다.
  5. HT-29 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하려면 6웰 플레이트를 실온에서 10분 동안 2,000 x g 에서 원심분리하거나 온도 설정을 조정할 수 있는 경우 37°C에서 원심분리합니다.
    알림: 원심분리는 HT-29 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하여 부착 인자의 필요성을 우회하고 박테리아가 세포에 빠르게 침입할 수 있도록 합니다.
  6. 37°C에서 5% CO2 로 45분 동안 6웰 플레이트를 배양합니다.
  7. 배양 중에 박테리아 감염 역가를 결정합니다.
    1. 재현탁 Shigella 세포의 10배 연속 희석액(6.3.3단계에서)을 PBS로 준비합니다.
    2. 1 x 10-5 및 1 x 10-6 희석액을 100μL의 TSB + 콩고 레드 플레이트에 담아 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: 1 x 10-5 및 1 x 10-6 희석액에서 100μL를 도금하면 각각 1 x 10-6 및 1 x 10-7의 최종 희석 계수에 해당합니다.
  8. 감염된 HT-29 세포를 PBS 1mL로 3회 철저히 세척합니다.
    1. 각 우물에서 매체를 흡입합니다.
      알림: 6웰 플레이트에서 매체를 흡입할 때 HT-29 셀과의 접촉을 피하면서 웰의 바닥면을 따라 흡입기 팁을 안내합니다.
    2. 각 웰에 따뜻한 PBS 1mL를 넣고 부드럽게 씻습니다.
      알림: PBS로 6웰 단층을 부드럽게 세척하려면 벤치탑에서 플레이트를 위아래로 좌우로 움직입니다. 플레이트를 원을 그리며 세척하거나 벤치탑 표면에서 플레이트를 제거하면 플라스틱에서 셀이 기계적으로 제거될 수 있습니다.
    3. 6.8.1 및 6.8.2 단계를 추가로 2 번 반복합니다.
  9. 흡인으로 PBS를 제거한 다음 50μg/mL 겐타마이신이 보충된 따뜻한 DMEM 2mL를 각 웰에 추가하고 5%CO2로 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  10. 감염된 HT-29 세포를 PBS 1mL로 3회 철저히 세척합니다.
    1. 세탁 단계 6.8을 반복합니다.
  11. 흡인으로 PBS를 제거한 다음 50μg/mL 겐타마이신이 포함된 따뜻한 DMEM 2mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 세포 내 복제(최대 24시간)를 허용하기 위해 원하는 시간 동안 5%CO2 로 37°C에서 배양합니다.
  12. 1mL의 PBS로 세포를 2배 철저히 세척합니다.
    1. 세탁 단계 6.8을 반복합니다.
  13. 흡인으로 PBS를 제거하고 각 웰에 1mL의 PBS + 1% Triton X-100을 추가하여 HT-29 세포를 용해합니다.
  14. 6웰 플레이트를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
  15. 세포 스크레이퍼 또는 구부러진 피펫 팁을 사용하여 웰 바닥에서 용해된 세포를 긁어내고 전체 1mL를 새 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다.
  16. 세포 내 박테리아의 수를 결정합니다.
    1. 용해된 진핵 세포에서 Shigella 를 추가로 치환하기 위해 각 튜브(6.15단계에서)를 최소 30초 동안 소용돌이칩니다.
    2. 용해물을 PBS로 10배 연속 희석하여 준비합니다.
    3. 1 x 10-2, 1 x 10-3 및 1 x 10-4 희석액을 TSB + Congo Red 플레이트에 100μL로 만들고 37°C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 1 x 10-2, 1 x 10-3 및 1 x 10-4 희석액에서 100μL를 도금하면 각각 1 x 10-3, 1 x 10-4 및 1 x 10-5의 최종 희석 계수에 해당합니다.

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Representative Results

S. flexneri 2457T 야생형(WT)과 Shigella 독성을 부정적으로 조절하는 것으로 가정된 돌연변이인 S. flexneri ΔVF(ΔVF)를 비교하여 부착, 침습 및 세포 내 복제 분석을 수행했습니다. Shigella는 독성을 조절하기 위한 신호로 담즙염을 사용하기 때문에(17,18,47), TSB 배지 및 0.4%(w/v) 담즙염이 보충된 TSB에서 박테리아 부배양 후 실험을 수행하였다 18. 하위배양 단계 동안의 담즙염 노출은 대장 감염 이전의 소장 통과를 복제하기 위한 전처리로서 작용한다 17,18,47. 그림 1은 ΔVF 돌연변이가 HT-29 결장 상피 세포에 부착하는 S. flexneri의 능력에 미치는 영향을 분석한 것입니다. 부착률은 y축에 표시되며 입력 박테리아 수에 대한 표준화된 HT-29 용해 후 회수된 박테리아의 비율을 나타냅니다. 예상한 바와 같이, S. flexneri WT 및 ΔVF 균주 모두 담즙염 보충을 하지 않은 TSB에 비해 담즙염 보충으로 과대배양했을 때 순응도가 유의하게 증가했다18. 그러나, 각 하위배양 조건 내에서 WT와 ΔVF 돌연변이 균주 간에 HT-29 세포에 대한 순응도에는 차이가 없었다. 이러한 데이터는 ΔVF 돌연변이가 담즙염 전처리의 유무에 관계없이 HT-29 상피세포에 부착하는 S. flexneri의 능력에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.

그림 2에서는 담즙염 전처리 유무에 관계없이 HT-29 결장 상피 세포 내부의 S. flexneri의 침입 능력(그림 2A) 및 복제(그림 2B)에 대한 ΔVF 돌연변이의 영향을 분석했습니다. 회수율은 y축에 표시되며 입력 박테리아 수에 대한 표준화된 HT-29 세포 용해 후 회수된 박테리아 세포의 비율을 나타냅니다. 그림 2A에서, 담즙염48에 사전 노출된 후 HT-29 세포에 침범하는 WT S. flexneri 2457T의 능력이 유의하게 증가할 것으로 예상된 반면, S. flexneri ΔVF 돌연변이체는 WT 균주에 비해 담즙염 사전 노출 후 침습의 증가가 더 적었다. ΔVF 돌연변이는 TSB에서 하위 배양된 WT에 비해 HT-29 세포의 침습률이 증가했지만, 담즙염이 보충된 TSB에서 하위 배양된 경우 WT와 유사한 침습률을 보였습니다(그림 2A). 이러한 결과는 ΔVF 돌연변이가 HT-29 세포에 침입하는 S. flexneri의 능력을 향상시킨다는 것을 시사하며, 이는 ΔVF 돌연변이의 침입 능력이 담즙염 하위 배양 후 더 증가했음에도 불구하고 담즙염 노출 전 영향을 감소시킵니다.

전반적으로, 90분 배양(그림 2A)에 비해 하룻밤 배양 후 10배 더 많은 박테리아가 회수되었으며(그림 2B), 이는 각각 세포 내 성장 모니터링과 침습 모니터링의 차이를 보여줍니다. 감염된 HT-29 세포를 박테리아의 세포 내 복제를 허용하기 위해 18시간 동안 배양했을 때(그림 2B), 담즙염 전처리의 영향은 WT 및 ΔVF 균주 모두에 대해 감소했습니다. 그러나, 세포 내 복제 중 담즙염 전처리의 감소된 효과는 ΔVF 돌연변이에 대해 더 극적이었습니다. 담즙염에 미리 노출되었을 때 두 균주의 세포 내 복제 증가가 동일한 조건에서 침습률의 증가보다 작았기 때문에 담즙염이 S. flexneri 발병 기전의 초기 단계에 더 큰 영향을 미친다는 가설을 세웠습니다. ΔVF 돌연변이는 두 가지 하위 배양 조건 모두에서 WT에 비해 HT-29 세포 내부의 하룻밤 복제에서 회수율이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2B). 그러나, ΔVF 돌연변이의 회수율은 담즙염 노출 전 여부에 관계없이 유사하였다. 이러한 데이터 추세는 ΔVF 돌연변이가 WT에 비해 HT-29 세포 내에서 더 효율적으로 복제되며, WT에서 관찰된 바와 같이 담즙염 사전 노출이 ΔVF 돌연변이의 세포 내 복제 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사합니다(그림 2B). 담즙염 사전 노출 조건에서 돌연변이 균주와 WT 균주 간의 차이가 90분 침습 분석 중에 관찰되지 않았기 때문에 삭제된 VF 유전자에 의해 인코딩된 산물이 HT-29 세포 내에서 S. flexneri 복제를 조절할 수도 있다는 가설을 세웠습니다. 두 분석의 결합은 ΔVF 돌연변이가 WT에 비해 더 독성이 높다는 것을 보여주며, 이는 VF 유전자 산물이 S. flexneri 독성의 음성 조절자임을 시사합니다.

Figure 1
그림 1: 담즙염 노출 전 유도 HT-29 세포에 대한 S. flexneri 의 부착. S. flexneri 2457T WT 및 ΔVF 돌연변이 세포를 0.4%(w/v) 담즙염(TSB+BS) 배지가 보충된 TSB 또는 TSB에서 과대배양했습니다. 그런 다음 박테리아를 100의 MOI(Multiplicity of Infection)에서 HT-29 세포에 적용하고 3시간 동안 배양하여 순응도를 검사했습니다. 배양 후, 감염된 HT-29 세포를 세척 및 용해하고, 회수된 박테리아의 연속 희석을 도약하여 mL당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)를 열거하였다. 부착 박테리아의 수는 부착 박테리아 역가를 기준으로 표시되어 부착 비율을 설정합니다. 데이터는 3개의 기술 복제(개별 점)가 있는 하나의 생물학적 복제물을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정(*p < 0.05; ***p < 0.001)에 의해 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 담즙염 사전 노출은 WT S. flexneri 침입 및 세포 내 복제를 증가시켰습니다. S. flexneri 2457T WT 및 ΔVF 돌연변이 세포를 담즙염(TSB+BS) 배지가 보충된 TSB 또는 TSB에서 과대배양하였다. 이어서, 박테리아를 100의 MOI로 HT-29 세포에 적용하고, 세포 상에 원심분리하고, 37°C에서 5%CO2 로 45분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 세포내 박테리아를 독점적으로 회수하기 위해 DMEM에 겐타마이신을 첨가하여 세포외 박테리아를 용해시켰다. 90분(A, 박테리아 침습) 또는 18시간(B, 세포내 복제) 배양 후, 감염된 HT-29 세포를 세척 및 용해하고, 회수된 박테리아의 연속 희석을 도화하여 mL당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)를 열거했습니다. 세포 내 박테리아의 수는 회수율을 설정하기 위해 입력된 박테리아 역가를 기준으로 표시됩니다. 데이터는 하나의 생물학적 복제물을 대표하며, 각 복제물에는 3개의 기술적 복제물(개별 점)이 있습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정(*p < 0.05)에 의해 결정되었습니다. 패널 (A)와 (B) 사이의 y축 스케일의 차이에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 장 상피 세포의 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 연구하기 위한 세 가지 표준화된 분석 세트를 설명합니다. 이러한 방법은 숙주 세포 내에서 다양한 박테리아 병원체의 침입 및 세포 내 복제를 연구하는 데 사용되는 고전적인 겐타마이신 분석법의 수정된 버전일 뿐이지만(49,50,51), Shigella를 연구할 때 특별한 고려사항이 적용되어야 합니다.

Shigella는 통성 혐기성 세균으로, 폭기43이 있는 풍부한 배지에서 37°C에서 최적으로 자랍니다. Shigella 감염에 대한 다양한 환경 신호 또는 대사 산물의 영향을 조사하기 위해 이러한 분석을 수행할 때 Shigella를 밤새 리치 배지에서 성장시킨 다음 감염 전 중간 로그 단계까지 정의 또는 보충된 배지로 하위 배양하는 것이 좋습니다. 최대 독성 유전자 발현은 대수 성장 단계 동안 발생한다52,53. 따라서 하룻밤 동안 Shigella 배양을 하고 박테리아가 기하급수적인 단계(OD600 ~ 0.7)로 성장하도록 하는 것은 Shigella 독성을 적절하게 평가하기 위해 필요한 단계입니다. 또한, 독성 유전자 발현은 온도에 따라 다릅니다. 숙주 감염 동안에만 발현에 대한 특이성을 보장하기 위해 독성 유전자는 숙주 생리학적 온도(37°C)에서 유도되고 더 낮은 온도(예: 30°C)에서 엄격하게 억제됩니다(54). 독성 유전자의 발현을 보장하기 위해 박테리아 하위 배양 및 감염은 37°C에서 수행되어야 하며, 온도가 37°C 이하로 떨어지지 않도록 적절한 주의를 기울여야 합니다. 침습 및 상피 세포 감염에 필요한 분자 메커니즘을 암호화하는 220 킬로베이스의 대형 독성 플라스미드는 모든 Shigella spp5에 대한 필수 독성 결정 인자입니다. 37°C에서 반복적인 패시징과 장기간의 성장은 독성 플라스미드 불안정성을 촉진하여 플라스미드 손실을 초래하고 이질균 세포를 무독성으로 만든다55. 독성 플라스미드 유지 및 중요한 독성 유전자의 발현을 보장하기 위해 2주마다 냉동고 재고에서 직접 박테리아를 신선한 TSB + 콩고 적색 표시판에 다시 스트리크하는 것이 좋습니다. 콩고 적색 한천은 야생형 독성(적색, CR+) 콜로니와 독성 플라스미드(45)를 상실한 무독성(백색, CR-) 콜로니를 구별하는데 사용할 수 있다. 병독성 플라스미드 불안정성이 반복적으로 관찰되면, 독성 플라스미드 손실을 방지하기 위해 Shigella의 하룻밤 배양을 30°C에서 배양한 후, 37°C에서 과배양하여 병독성 유전자 발현을 촉진할 수 있다43. 마지막으로, 이러한 박테리아 균주에 항생제 마커가 존재하는 돌연변이 및/또는 보완 균주를 사용한 분석이 수행되는 경우, 박테리아 야간 및 과배양 단계에서 적절한 항생제 선택을 사용하는 것이 좋습니다.

HT-29 상피 단층의 사용은 시험관 내에서 Shigella 발병 기전의 분자 메커니즘을 연구하는 데 많은 이점이 있습니다. 이질균은 인간에 적응된 병원체이기 때문에, 소동물 모델은 인간에서 관찰되는 이질균의 특징적인 발병기전을 정확하게 반영하지 못한다36. 따라서 인간 유래 세포주의 감염에 대한 표준화된 프로토콜을 사용하면 박테리아 발병의 개별 단계에 대한 정량적 조사를 통해 이 병원체와 네이티브 숙주 간의 분자 상호 작용을 특성화할 수 있습니다. 역사적으로 HeLa 세포는 주로 in vitro 25,56,57에서 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 HeLa 세포는 불멸의 자궁경부암 세포주로, 장내 세균성 병원체의 비토착 숙주 세포입니다. 따라서, 장 발병 기전에 대한 시험관 내 연구는 대장 선암 세포주(예: HT-29, Caco-2 및 T84)를 사용하는 것으로 전환되었으며, 이는 장 상피 형태를 보다 충실하게 재현하고, 정점 및 기저외측 58,59,60 분화된 상피 단층으로 트랜스웰에서 성장할 수 있습니다. 각 세포주에는 개별적인 강점과 약점이 있지만, HT-29 세포는 장 장세포와의 표현형 유사성과 세포 표면 수용체 및 전염증성 사이토카인의 강력한 발현으로 인해 여기에 설명된 분석에 사용됩니다 58,59,61. 그러나, 논의된 이들 각각의 모델들은 생체내 결장 상피의 자연적인 생리학적 상태를 정확하게 나타내지 않는 비정상적인 대사 및 성장 표현형을 갖는 암 유래 세포주이다(58). 최근 인체 조직 배양 기술의 발전으로 조직 생검에서 얻은 인간 장 줄기 세포를 인간 위장관(GI)에 존재하는 다양한 세포 유형을 재현하는 오가노이드 또는 단일 2차원 세포 단층으로 배양할 수 있게 되었습니다 62,63,64. 장 오가노이드는 장세포, 점액 생성 잔 세포, M 세포 및 기타 조직 특이적 세포 유형을 포함하도록 분화할 수 있습니다. 최근 연구에서는 다양한 Shigella spp., Salmonella enterica 및 Escherichia coli pathovars 62,63,64를 포함한 장내 병원체를 연구하기 위해 이러한 오가노이드 모델의 사용을 검증했습니다. 오가노이드는 인간 위장관 상피의 보다 정확한 모델이고 전 세계 인구를 대표하기 위해 다양한 영양 조건에서 배양될 수도 있지만65, 오가노이드의 상대적 복잡성으로 인해 상당한 교육과 기술 전문 지식이 필요하므로 기존 암 세포주에 비해 비용이 더 많이 들고 배양 시간이 더 길어집니다(58).

이 프로토콜은 테스트에 사용할 수 있는 총 12개의 단층에 대해 2개의 6웰 플레이트를 사용하는 중간 처리량 방법을 설명합니다. 그러나 추가 기술 복제를 수용하기 위해 시드된 단층의 수를 늘리거나 추가 Shigella 돌연변이 및 환경 신호를 테스트하기 위해 실험을 쉽게 확장할 수 있습니다. 더 많은 웰이 있는 조직 배양 플레이트(예: 12-웰 또는 24-웰 플레이트)는 직경이 더 작은 웰을 설명하기 위해 적절하게 조정하여 사용할 수도 있습니다. 단계 3.2에서 설명한 HT-29 성장 조건 하에서, HT-29 역가는 하나의 T75 플라스크에서 배양 후 약 6개의 6-웰 플레이트를 파종하기에 충분하며, HT-29 세포 배양을 유지하기에 충분한 세포가 남아 있습니다. 또한, HT-29 단층의 파종 및 접종 박테리아 단계의 준비는 박테리아 부착, 침습 및 세포 내 복제 분석 간에 동일합니다. 따라서, 동일한 Shigella 균주 또는 과배양 조건을 시험하는 분석법은 Shigella 감염의 다양한 단계에서 각 실험 조건의 역할을 동시에 검사하기 위해 쉽게 병렬로 수행될 수 있습니다.

부착성(4단계), 침입성(5단계) 및 세포내 박테리아(6단계)에 대한 회수 역가는 용해 후 감염된 HT-29 세포의 연속 희석액을 도금하여 측정되며, 이를 통해 Shigella 감염의 각 단계의 효율성을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 고전적 분석 49,50,51을 기반으로 하는 침습 및 세포 내 복제 분석의 원심분리 단계는 즉각적인 침입을 위해 숙주 세포와의 박테리아 접촉을 촉진하고 침입률을 향상시킵니다. 따라서 원심분리는 부착 단계를 "건너뛰고" 나중에 Shigella 감염 17,18,19,66의 중요한 측면으로 밝혀졌습니다. 원심분리기 단계는 트랜스웰(transwell)에 파종된 편광된 상피세포(polarized epithelial cell)로는 수행할 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 부착 분석의 경우 원심분리에 의해 부착이 강제되지 않으며 용해 전에 감염된 HT-29 세포에 겐타마이신을 첨가하지 않으므로 부착 박테리아 세포를 열거할 수 있습니다. 조직 배양 배지의 부피는 1mL로 감소하여(침습 및 세포 내 복제 분석의 경우 2mL와 반대) 박테리아와 HT-29 세포의 보다 효율적인 접촉을 가능하게 합니다. 또한, 부착률에 따라 3시간 배양 동안 일부 침습 및 세포 내 복제가 발생할 수 있지만 그 양은 일반적으로 무시할 수 있습니다(예: 숙주 세포 용해 후 회수된 박테리아 개체군의 0.05%에 불과함). 그럼에도 불구하고, 3시간 배양 동안 부착성 박테리아와 세포 내 박테리아를 적절하게 설명하기 위해, 명시된 프로토콜 외에도 두 번째 플레이트에 웰당 2mL의 DMEM에 50μg/mL의 겐타마이신을 넣어 총 45분 동안 배양하여 총 45분(15분 배양, 세척, 신선한 DMEM + 겐타마이신 30분)하여 세포외 박테리아를 완전히 용해하는 병렬 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 프로토콜에 명시된 HT-29 세포 용해 후 세포 내 박테리아는 위에서 언급한 대로 열거될 수 있으며 침입한 박테리아의 수를 나타냅니다. 그런 다음 겐타마이신 처리 없이 플레이트에서 열거된 박테리아에서 이 값을 빼서 부착 박테리아와 침입 박테리아를 적절하게 결정할 수 있습니다. 또한 침습 후 HT-29 세포 내에서 Shigella의 세포 내 복제에 대한 더 많은 통찰력을 제공하기 위해 병렬 분석을 수행할 수 있습니다(예: 세포 내 성장 곡선을 수행하기 위해 여러 시점을 사용). 마지막으로, 18시간 겐타마이신 배양 후 세포 내 박테리아를 열거하는 것과 함께 배양 상층액을 수집하여 감염된 HT-29 세포의 사이토카인 분비를 분석할 수 있습니다. 예를 들어, IL-8은 상피 세포에서 분비되는 케모카인으로, 주로 PMN을 감염 부위로 유도하는 기능을 합니다. 감염된 HT-29 세포의 배양 배지로 분비되는 IL-8의 양은 IL-8 ELISA 분석법(67)으로 분석할 수 있다.

담즙염은 인간 위장관 시스템을 통과하는 동안 이질균에 대한 중요한 독성 신호임이 입증되었으며, 이러한 프로토콜에서 박테리아 성장 배지를 보완하여 전형적인 위장관 상태를 복제하는 데 사용할 수 있습니다. 자연적으로, 담즙염은 소화를 돕기 위해 소장의 십이지장 또는 상부에 도입됩니다. 그리고 소장의 말단 회장 또는 말단에서 담즙염의 95%가 제거되어 담낭에 최종적으로 침착되도록 순환으로 다시 재활용된다68. 담즙염은 일반적으로 소장에서 0.2%-2.0%(w/v) 사이의 농도를 가지며 자연적으로 살균 효과가 있습니다. 그러나 시겔라균은 대부분의 장내 세균과 마찬가지로 담즙염에 저항하고 감염을 촉진하기 위해 신호를 이용한다47. 여러 연구에서 담즙염 노출이 포도당과 같은 다른 소장 신호와 함께 감염 전 이질균 생존 및 독성 조절에 어떻게 영향을 미치는지 문서화했습니다. Shigella는 담즙 염에 저항하고, 유전자 발현을 바꾸고, 소장 통과를 재생하는 조건에서 생물막을 형성하고 분산시키는 것으로 나타났습니다17,69. 이 연구는 이러한 변화가 Shigella 17,18,19,48,66에 의한 후속 결장 감염 시 부착 및 침습이 유도되는 고독성 표현형을 초래한다는 것을 입증했습니다. 따라서 위에서 설명한 조건은 부착, 침습 또는 세포 내 복제 분석을 수행하기 전에 소장 통과를 모방하기 위해 담즙염에서 Shigella를 하위 배양하는 방법을 문서화합니다. 지정된 TSB 제형에는 일반적인 루리아 국물(LB)에 비해 첨가된 포도당이 포함되어 있습니다17. 따라서, LB가 사용되는 경우, 소장에서의 포도당 신호를 적절하게 고려하기 위해 글루코스(0.5%-2.0%[w/v])로 배지를 보충하는 것도 중요하다17. 또한, 위에서 언급했듯이 모든 Shigella 하위 배양은 담즙염을 제거하고 감염 분석을 위해 결장으로의 전이를 모방하기 위해 세척됩니다.

전통적으로 위의 결과(그림 1 및 그림 2)에서 강조된 바와 같이 감염 분석은 Shigella 감염에서 특정 유전자의 역할을 결정하는 데 중요합니다. 그러나 다양한 돌연변이의 표현형은 박테리아 배양 배지의 적절한 보충 없이는 진정으로 평가되지 않을 수 있습니다. 선행 연구에서 입증된 바와 같이, 담즙염은 중추 대사를 위한 유전자, 전사 인자, 당 수송체, 약물 내성 및 염색체 또는 독성 플라스미드에 암호화되어 있는 독성 유전자를 포함하여 S. flexneri 유전자 발현을 크게 변화시킨다17. 이러한 유전자는 Shigella가 유전자 발현을 변경하고 결장의 궁극적인 감염을 준비하기 위한 신호로 담즙염을 사용하는 방법에 대한 통찰력을 제공하며, 따라서 부착, 침습 및 세포 내 복제 분석에서 독성에 대한 영향을 조사하기 전에 적절한 보충된 박테리아 성장 배지에서 후속 돌연변이 분석을 수행해야 합니다. 위의 그림 1과 그림 2에서 볼 수 있듯이 ΔVF 돌연변이는 순응도에 영향을 미치지 않았지만 침습 및 세포 내 복제에 영향을 미쳤습니다. 돌연변이가 침입과 세포 내 복제를 강화했기 때문에 유전자 산물이 감염을 조절하는 방법을 결정하기 위한 실험이 현재 진행 중입니다. 돌연변이 분석은 특히 인간 위장관을 더 잘 복제하는 조건에서 Shigella 발병기전에 대한 새로운 이해를 연구할 수 있는 방법의 예입니다. 다양한 돌연변이의 표현형을 검증하기 위해 적절한 보완 분석이 권장됩니다.

이러한 절차는 감염 중 인간 위장관의 자연 환경을 가장 잘 모방하여 HT-29 결장 상피 세포에 대한 Shigella 부착, 침입 및 복제의 분자 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하는 정량적 실험을 설명합니다. 향후 연구는 돌연변이와 실험 조건을 확장하여 Shigella 가 인간 숙주를 준비하고 효과적으로 감염시키는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다. 수십 년간의 연구에도 불구하고 이질균 감염에 대해 밝혀야 할 것이 훨씬 더 많습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

저자에 대한 지원에는 매사추세츠 종합병원 소아과, 연구 중간 지원 기금 집행 위원회(ISF) 상 2022A009041, 국립 알레르기 및 전염병 연구소 보조금 R21AI146405, 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 보조금 하버드 영양 비만 연구 센터(NORCH) 2P30DK040561-26이 포함됩니다. 연구비 지원자들은 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 출판 결정, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

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References

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Immunology and Infection Shigella 부착 침습 세포 내 복제 발병기전 독성 인자 상피 세포 담즙염
<em>Shigella</em>를 사용한 상피 세포 감염 분석
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Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, … More

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

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