Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Epitelcelleinfektionsanalyser med Shigella

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver infektionsanalyser for at forhøre Shigella-adhærens , invasion og intracellulær replikation ved hjælp af in vitro-epitelcellelinjer .

Abstract

Det mennesketilpassede enteriske bakterielle patogen Shigella forårsager millioner af infektioner hvert år, skaber langsigtede væksteffekter blandt pædiatriske patienter og er en førende årsag til diarrédødsfald over hele verden. Infektion inducerer vandig eller blodig diarré som følge af, at patogenet passerer mave-tarmkanalen og inficerer epitelcellerne, der forer tyktarmen. Med svimlende stigninger i antibiotikaresistens og den nuværende mangel på godkendte vacciner er standardiserede forskningsprotokoller afgørende for at studere dette formidable patogen. Her præsenteres metoder til at undersøge den molekylære patogenese af Shigella ved hjælp af in vitro-analyser af bakteriel adhærens, invasion og intracellulær replikation i colonepitelceller. Før infektionsanalyser blev virulensfænotypen i Shigella-kolonier verificeret ved optagelse af Congos røde farvestof på agarplader. Supplerede laboratoriemedier kan også overvejes under bakteriel dyrkning for at efterligne in vivo-forhold . Bakterieceller anvendes derefter i en standardiseret protokol til at inficere kolonepitelceller i vævskulturplader ved en etableret mangfoldighed af infektion med tilpasninger til at analysere hvert infektionsstadium. Til adhærensanalyser inkuberes Shigella-celler med reducerede medieniveauer for at fremme bakteriel kontakt med epitelceller. Til både invasions- og intracellulære replikationsassays anvendes gentamicin i forskellige tidsintervaller for at eliminere ekstracellulære bakterier og muliggøre vurdering af invasion og / eller kvantificering af intracellulære replikationshastigheder. Alle infektionsprotokoller opregner vedhængende, invaderede og / eller intracellulære bakterier ved serielt fortynding af inficerede epitelcellelysater og plettering af bakteriekolonidannende enheder i forhold til inficerende titere på Congo røde agarplader. Sammen muliggør disse protokoller uafhængig karakterisering og sammenligninger for hvert trin i Shigella-infektion af epitelceller for at studere dette patogen med succes.

Introduction

Diarrésygdomme forårsaget af enteriske bakterielle patogener er en betydelig global sundhedsbyrde. I 2016 var diarrésygdomme ansvarlige for 1,3 millioner dødsfald på verdensplan og var den fjerde førende dødsårsag hos børn yngre end fem år 1,2. Det gramnegative, enteriske bakterielle patogen Shigella er årsagsmidlet til shigellose, en væsentlig årsag til diarrédødsfald over hele verden3. Shigellose forårsager betydelig sygelighed og dødelighed hvert år hos børn fra lav- og mellemindkomstlande 4,5, mens infektioner i højindkomstlande er forbundet med daginstitutioner, fødevarebårne og vandbårne udbrud 6,7,8,9. Ineffektiv vaccineudvikling10 og stigende antimikrobiel resistens (AMR)11,12 har kompliceret håndteringen af store Shigella-udbrud. Nylige data fra Centers for Disease Control and Prevention viser, at næsten 46% af Shigella-infektioner i USA viste lægemiddelresistens i 202013,14, mens Verdenssundhedsorganisationen har erklæret Shigella som et AMR-prioriteret patogen, for hvilket der er presserende behov for nye terapier15.

Shigella-infektioner overføres let via fækal-oral vej ved indtagelse af forurenet mad eller vand eller gennem direkte menneskelig kontakt. Shigella har udviklet sig til at være et effektivt, menneskeligt tilpasset patogen med en infektiøs dosis på 10-100 bakterier, der er tilstrækkelige til at forårsage sygdom16. Under tyndtarmens transit udsættes Shigella for miljøsignaler, såsom forhøjet temperatur og galde17. Påvisning af disse signaler inducerer transkriptionelle ændringer for at udtrykke virulensfaktorer, der forbedrer bakteriernes evne til at inficere den menneskelige tyktarm 17,18,19. Shigella invaderer ikke colonepitelet fra den apikale overflade, men passerer snarere over epitellaget efter optagelse i specialiserede antigenpræsenterende mikrofoldceller (M-celler) inden for follikelassocieret epitel 20,21,22. Efter transcytose fagocyteres Shigella-celler af residente makrofager. Shigella undslipper hurtigt fagosomet og udløser makrofagcelledød, hvilket resulterer i frigivelse af proinflammatoriske cytokiner 5,23,24. Shigella invaderer derefter colonepitelceller fra den basolaterale side, lyserer den makropinocytiske vakuol og etablerer en replikativ niche i cytoplasma 5,25. Proinflammatoriske cytokiner, især interleukin-8 (IL-8), rekrutterer polymorfonukleære neutrofile leukocytter (PMN'er) til infektionsstedet, hvilket svækker epiteltætte kryds og muliggør bakteriel infiltration af epitelforingen for at forværre basolateral infektion5. PMN'erne ødelægger den inficerede epitelforing for at indeholde infektionen, hvilket resulterer i de karakteristiske symptomer på bacillær (blodig) dysenteri5. Selvom invasions- og intracellulære replikationsmekanismer er blevet grundigt karakteriseret, viser ny forskning vigtige nye begreber i Shigella-infektion, herunder virulensregulering under gastrointestinal (GI) transit17, overholdelse19, forbedret basolateral adgang gennem barrierepermeabilitet26 og asymptomatisk transport hos underernærede børn27.

Shigella spp.'s evne til at forårsage diarrésygdom er begrænset til mennesker og ikke-menneskelige primater (NHP)28. Shigella tarminfektionsmodeller er udviklet til zebrafisk29, mus30, marsvin31, kaniner 21,32,33 og svin34,35. Ingen af disse modelsystemer kan imidlertid nøjagtigt replikere de sygdomskarakteristika, der observeres under infektionhos mennesker 36. Selvom NHP-modeller af shigellose er blevet etableret for at studere Shigella-patogenese, er disse modelsystemer dyre at implementere og kræver kunstigt høje infektiøse doser, op til ni størrelsesordener højere end den infektiøse dosis af mennesker 37,38,39,40,41,42. Således nødvendiggør den bemærkelsesværdige tilpasning af Shigella til infektion af menneskelige værter brugen af humanafledte cellekulturer til at genskabe fysiologisk relevante modeller til nøjagtig forhør af Shigella-patogenese.

Her beskrives detaljerede procedurer til måling af hastigheden af Shigella-vedhæftning , invasion af og replikation inden for HT-29 colonepitelceller. Ved hjælp af disse standardiserede protokoller kan de molekylære mekanismer, hvormed bakterielle virulensgener og miljøsignaler påvirker hvert trin i Shigella-infektion , forhøres for bedre at forstå det dynamiske værtspatogeninteraktionsforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af reagenser og materialer

BEMÆRK: Alle volumener er i overensstemmelse med et assay ved hjælp af to 6-brønds plader.

  1. TSB-medium: Tilsæt 0,5 L deioniseret (DI) vand til 15 g tryptisk sojabouillon (TSB, se materialetabel) medium og autoklave. Opbevares ved stuetemperatur.
  2. Galdesaltmedium (TSB + BS): For at forberede TSB indeholdende 0,4% (w / v) galdesalte resuspenderes 0,06 g galdesalte (BS, se materialetabel) i 15 ml autoklaveret TSB. Filtersteriliser ved hjælp af et 0,22 μm PES-filter.
    BEMÆRK: Galdesaltene består af en 1:1 blanding af natriumcholat og natriumdeoxycholat. Forbered friske medier umiddelbart før brug.
  3. DMEM + 10% (v / v) FBS: Tilsæt 5 ml føtalt bovint serum (FBS) til 45 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM). Opbevares ved 4 °C.
  4. DMEM + gentamicin: Til et 50 ml rør tilsættes 50 ml DMEM og 50 μL 50 mg / ml gentamicin (se materialetabel).
    BEMÆRK: Lav frisk alikvote og varm i et 37 °C vandbad før hvert forsøg.
  5. PBS + 1% (v / v) Triton X-100: Tilsæt 150 μL Triton X-100 til 15 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
    BEMÆRK: Lav frisk alikvote og varm i et 37 °C vandbad før hvert forsøg.
  6. TSB + Congo røde indikatorplader: Tilsæt 15 g TSB, 7,5 g udvalgt agar og 0,125 g Congo rødt farvestof (se materialetabel) til en 1 L flaske. Tilsæt 0,5 L DI vand og autoklave. Hæld 10-20 ml medier i individuelle sterile petriskåle (100 mm x 15 mm) og lad størkne.
    FORSIGTIG: Congorød er kræftfremkaldende og et reproduktivt toksin. Sørg for, at håndtering af Congo rød udføres ved hjælp af passende personlige værnemidler. Se databladet om produktsikkerhed for yderligere oplysninger.
    BEMÆRK: Ca. 20 plader er lavet af 0,5 L Congo røde medier. Plader kan fremstilles 2-3 dage i forvejen og efterlades omvendt ved stuetemperatur indtil brug. Ved langtidsopbevaring anbringes omvendte plader i plasthylstre ved 4 °C i op til 3 måneder.
  7. DMEM + 10% (v / v) FBS og 5% (v / v) dimethylsulfoxid (DMSO): Tilsæt 42,5 ml DMEM, 5 ml FBS og 2,5 ml DMSO til et 50 ml rør. Opbevares ved 4 °C.

2. Forberedelse af bakterier

BEMÆRK: Alle Shigella laboratoriedyrknings- og opbevaringsprotokoller er tilpasset fra Payne, S. M.43.

FORSIGTIG: Shigella spp. er risikogruppe 2-patogener44. Udfør alt laboratoriearbejde i et BSL-2-miljø med yderligere sikkerhedsforanstaltninger for at begrænse utilsigtet eksponering på grund af den lave infektiøse dosis Shigella spp.

  1. Vækst af Shigella fra frosne lagre
    1. Overfør en lille mængde frossen kultur fra det kryogene hætteglas til en TSB + Congo rød agarplade ved hjælp af en steril applikator.
    2. Flammesteriliser en podningssløjfe og lad den køle af. Stribe inokulum frem og tilbage over en kvadrant af pladen. Flamme løkken, lad den køle af, og strib derefter fra den første kvadrant til den anden kvadrant på pladen. Gentag for at stribe inokulum i pladens tredje og fjerde kvadrant.
      BEMÆRK: Alternativt kan du stryge inokulum ved hjælp af en frisk steril applikator mellem hver kvadrant.
    3. Pladen vendes på hovedet, og den inkuberes ved 37 °C natten over.
      BEMÆRK: Inkubation ved temperaturer ≥37 °C er nødvendig for ekspression af Shigella virulensfaktorer, der er nødvendige for observation af Congo rød-positiv (CR+) fænotype45. Avirulente kolonier vil have et hvidt udseende og vil ikke være invasive.
    4. Pladen forsegles med paraffinfilm og opbevares nedkølet ved 4 °C.
      BEMÆRK: Bakteriekolonier forbliver levedygtige på agarplader i 1-2 uger.
  2. Vækst af Shigella natten over i flydende kultur
    1. Alikvote 3 ml TSB-medier i sterile 14 ml kulturrør.
    2. Vælg en enkelt, velisoleret rød (CR +) koloni ved hjælp af en steril applikator og resuspender i flydende medier.
    3. Kulturerne inkuberes natten over (16-18 timer) ved 37 °C under omrystning ved 250 omdrejninger pr. minut (rpm).

3. Fremstilling af HT-29 eukaryote celler

BEMÆRK: Alle volumener er i overensstemmelse med et assay ved hjælp af to 6-brønds plader. HT-29 cellelinjer blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC). HT-29 vedligeholdelsesprotokoller er tilpasset fra ATCC anbefalinger46. Alle medier skal forvarmes i vandbad ved 37 °C før brug. Alle HT-29 vedligeholdelsesprotokoller skal udføres i et biosikkerhedsskab. Afstå fra at producere bobler, når du blander / arbejder med HT-29-celler i medier for at undgå dramatiske ændringer i pH.

  1. Optøning af HT-29-celler fra frosset lager
    1. Optø hætteglasset med HT-29-celler i et 37 °C vandbad.
      BEMÆRK: Sørg for, at hætten forbliver helt over vandet for at undgå forurening. Optøning bør tage mindre end 2 min.
    2. Fjern hætteglasset fra vandet umiddelbart efter, at kulturen er helt optøet, og dekontaminer med 70% ethanol. Sørg for, at alle trin fra dette punkt udføres ved hjælp af aseptiske teknikker.
    3. Tilsæt alt indholdet af hætteglasset til et 15 ml centrifugeglas indeholdende 9 ml DMEM + 10% FBS. Der centrifugeres ved 125 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Supernatanten dekanteres i en affaldsbeholder og pelletten resuspenderes i 10 ml varm DMEM + 10% FBS. Resuspenderede celler overføres til en 75 cm2 vævskulturkolbe (T75) indeholdende 10 ml varm DMEM + 10% FBS (samlet volumen på 20 ml).
    5. Inkuber celler ved 37 °C med 5% CO2 , indtil cellerne når 90% sammenløb (ca. 6-7 dage).
      BEMÆRK: Sammenløb estimeres gennem visuel tilnærmelse.
  2. Såning af HT-29-celler
    1. Forvarm 20 ml PBS og 50 ml DMEM + 10% FBS i et 37 °C vandbad og forvarm 3 ml 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA til stuetemperatur.
    2. Når HT-29-celler (fra trin 3.1) når 90% sammenløb, dekanteres HT-29-cellekulturmedier fra T75-kolben i en affaldsbeholder. Hæld ~10 ml varm PBS i kolben og hvirvl forsigtigt rundt for at vaske. Dekanter PBS i en affaldsbeholder. Vask med varm PBS igen og dekanter.
    3. Tilsæt 2-3 ml 0,25% (w / v) Trypsin-EDTA og hvirvl forsigtigt over hele overfladearealet. Der inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 4 minutter.
    4. Fjern kolben fra inkubatoren og hvirvl forsigtigt Trypsin-EDTA, hvilket visuelt sikrer, at alle celler løsner sig fra overfladen.
    5. Tilsæt straks 6 ml varm DMEM + 10% FBS for at deaktivere Trypsin. Pipette op og ned for at blande grundigt.
    6. Overfør alt indholdet til et 15 ml centrifugerør og drej det ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    7. Supernatant dekanteres forsigtigt i en affaldsbeholder og opslæmmes igen i 6 ml varm DMEM + 10% FBS.
    8. Umiddelbart efter resuspension overføres 10 μL suspenderede HT-29-celler fra midten af kulturen til et 0,2 ml PCR-rør. Tilsæt 10 μL trypanblåt farvestof til PCR-røret og bland.
    9. Tilsæt 10 μL HT-29 celle/trypanblå blanding til et engangs grevinde celle tællerkammerglas (se tabel over materialer). Opregne antallet af levende celler og beregne cellelevedygtighed.
      BEMÆRK: Når du dokumenterer antallet af celler i prøven, skal du læse tallet under "live" celleantal, ikke det samlede celleantal. Alternativt kan celletælling udføres manuelt ved hjælp af et hæmocytometer.
    10. Frø resuspenderet HT-29 celler i en frisk T75 kolbe eller 6-brønd plade.
      1. For kolbe T75:
        1. Pipet blandes forsigtigt, hvorefter 2,5 x 106 celler overføres til en frisk T75-kolbe i henhold til nedenstående ligning:
          Equation 1
        2. Tilsæt varme DMEM + 10% FBS-medier til et slutvolumen på 20 ml (slutkoncentration på 1,25 x 105 celler/ml).
        3. Cellerne fordeles jævnt over kolben ved forsigtigt at rokke frem og tilbage.
        4. Der inkuberes ved 37 °C med 5% CO2, indtil cellerne når 80 % sammenløb.
          BEMÆRK: For optimal vækst skal du udskifte DMEM + 10% FBS-mediet i T75-kolben hver ~3 dage. Dekanter medier i en affaldsbeholder, og tilsæt 10 ml varm PBS til kolben. Hvirvl forsigtigt PBS rundt og dekanter det i affaldsbeholderen. Derefter tilsættes 20 ml frisk, varm DMEM + 10% FBS til kolben og vender tilbage til 37 °C, 5% CO2 -inkubatoren.
      2. Til 6-brønds plade:
        1. Pipet forsigtigt for at blande, og overfør derefter 5,85 x 106 celler til et frisk 50 ml konisk rør i henhold til nedenstående ligning:
          Equation 2
        2. Tilsæt varme DMEM + 10% FBS-medier til et slutvolumen på 26 ml (slutkoncentration på 2,25 x 105 celler/ml).
        3. Pipet forsigtigt for at blande, og dispenser derefter 2 ml (4,5 x 105 celler) i individuelle huller med 6-brøndplader.
        4. Spred cellerne jævnt over brønden ved forsigtigt at vugge op/ned og venstre/højre 2-3x.
        5. Der inkuberes ved 37 °C med 5% CO2, indtil cellerne når 80 % -95 % sammenløb (ca. 3-4 dage).
          BEMÆRK: 85% sammenløb anbefales til invasion og intracellulære replikationsassays, mens 90% -95% sammenløb anbefales til adhærensassays. Celler skal nå ~ 85% sammenløb efter 48 timers inkubation med en endelig koncentration på ca. 1 x 106 celler / brønd. Det kan være nødvendigt at justere antallet af podede celler og inkubationens varighed.
  3. Fremstilling af frosne HT-29-lagre
    1. Alikvote 1 ml DMEM + 10% FBS + 5% DMSO-medier i individuelle kryogene hætteglas.
    2. Der tilsættes 1 x 106 HT-29-celler fra trin 3.2.7 til hvert hætteglas. Beregn mængden af celler i henhold til nedenstående formel:
      Equation 3
    3. Opbevar HT-29-celler på lang sigt under -130 °C i fryser til opbevaring af flydende nitrogendampe.

4. Analyse af overholdelse

BEMÆRK: Alle volumener er i overensstemmelse med et assay ved hjælp af to 6-brønds plader.

  1. Subkultur natten over Shigella kulturer via 1:50 fortynding til friske medier.
    1. Vortex, tilsæt derefter 100 μL af hver kultur natten over til 5 ml frisk TSB eller TSB + BS i et dyrkningsrør af passende størrelse.
      BEMÆRK: Begræns kulturvolumen til <20% af dyrkningskolben eller rørvolumen for at sikre korrekt beluftning.
    2. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 omdr./min., indtil cellerne når en optisk densitet (OD600) på 0,7 (midterste logningsfase af Shigella-væksten ); ca. 2-2,5 timer.
      BEMÆRK: Under subkulturen alikvote 50 ml DMEM og en tilstrækkelig mængde PBS til alle vasketrin og anbringes i et 37 °C vandbad. Lad mediet nå 37 °C før brug.
  2. Overfør 2 x 108 kolonidannende enheder (CFU'er) subkulturerede Shigella til individuelle 2 ml mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: 2 x 108 CFU'er svarer til ca. 1 ml bakterieceller ved en OD600 på 0,7. Brug OD600-aflæsninger til at tilnærme CFU / ml i henhold til kalibreringen af hvert enkelt spektrofotometer.
  3. Hver Shigella-prøve vaskes 2x med PBS.
    1. Pilleceller ved centrifugering ved 17.000 x g i 2 min ved stuetemperatur. Supernatanten suges op, derefter tilsættes 1 ml varm PBS, og pelletsbrønden opslæmmes, idet prøven forsigtigt pipetteres op og ned, indtil blandingen er fuldstændig homogen (8-10x).
    2. Gentag trin 4.3.1 1x ekstra tid.
    3. Pilleceller ved centrifugering ved 17.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur, opsuger supernatanten, og pellets resuspenderes i 2 ml varm DMEM.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af resuspenderede bakterier vil være 1 x 108 CFU/ml.
  4. Vortex, derefter tilsættes 1 ml (1 x 108 CFU'er) resuspenderet Shigella til hvert hul i de forberedte HT-29 colonepitelmonolag i 6-brøndplader (fra trin 3.2.10.2).
    BEMÆRK: Infektioner udføres normalt ved en mangfoldighed af infektion (MOI; forholdet mellem bakterie- og epitelceller) på 100. For at teste forskellige MOI'er fortyndes resuspenderet Shigella i varm DMEM til den ønskede koncentration og tilsættes derefter 1 ml fortyndede bakterier til HT-29 monolag. For eksempel, for at teste en MOI på 10, fortynd bakterier 1:10 ved at tilføje 150 μL 1 x 108 CFU / ml bakterier til 1,35 ml varm DMEM, og påfør derefter 1 ml (1 x 107 CFU'er) til HT-29-celler.
  5. 6-brøndspladerne inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 3 timer.
  6. Under inkubationen bestemmes bakterieinfektiontiteren.
    1. Der fremstilles 10 gange serielle fortyndinger af resuspenderede Shigella-celler (fra trin 4.3.3) i PBS.
    2. Plade 100 μL af 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortyndingerne på TSB + Congo røde plader og inkuberes natten over ved 37 °C.
      BEMÆRK: Belægning af 100 μL fra 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortyndingerne svarer til en endelig fortyndingsfaktor på henholdsvis 1 x 10-6 og 1 x 10-7.
  7. Efter inkubation vaskes monolagene 4-5x med PBS.
    1. Aspirer medier fra hver brønd.
      BEMÆRK: Når du aspirerer medier fra 6-brøndplader, skal du føre spidsen af aspiratoren langs undersiden af brøndene og forsøge at undgå kontakt med HT-29-cellerne.
    2. Tilsæt 1 ml varm PBS til hver brønd og vask forsigtigt.
      BEMÆRK: For forsigtigt at vaske 6-brønds monolag med PBS skal du flytte pladen op og ned og side til side på bordpladen. Vask af plader i cirkulære bevægelser og / eller fjernelse af pladen fra bordpladens overflade kan forårsage mekanisk fjernelse af celler fra plast.
    3. Gentag trin 4.7.1 og 4.7.2 4x yderligere gange.
  8. PBS fjernes ved aspiration og lyser HT-29-celler ved at tilsætte 1 ml PBS + 1% Triton X-100 til hvert hul.
  9. Der inkuberes plader med 6 brønde ved 37 °C i 5 minutter.
  10. Brug en celleskraber eller en bøjet pipettespids til at skrabe de lyserede celler fra bunden af brønden og overføre hele 1 ml til et frisk 1,7 ml mikrocentrifugerør.
  11. Bestem antallet af celleassocierede bakterier.
    1. Vortex hvert rør (fra trin 4.10) i mindst 30 s for yderligere at fortrænge Shigella fra de lyserede eukaryote celler.
    2. Forbered 10 gange serielle fortyndinger af lysater til PBS.
    3. Plade 100 μL af 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortyndinger på TSB + Congo røde plader og inkuberes natten over ved 37 °C.
      BEMÆRK: Belægning af 100 μL fra 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortyndinger svarer til en endelig fortyndingsfaktor på henholdsvis 1 x 10-3, 1 x 10-4 og 1 x 10-5.

5. Analyse af invasion

BEMÆRK: Alle volumener er i overensstemmelse med et assay ved hjælp af to 6-brønds plader.

  1. Subkultur natten over Shigella kulturer via 1:50 fortynding til friske medier.
    1. Vortex, tilsæt derefter 100 μL af hver kultur natten over til 5 ml frisk TSB eller TSB + BS i et dyrkningsrør af passende størrelse.
      BEMÆRK: Begræns kulturvolumen til <20% af dyrkningskolben eller rørvolumen for at sikre korrekt beluftning.
    2. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 omdr./min., indtil cellerne når en OD600 på 0,7 (midterste logfase af Shigella-væksten ); ca. 2-2,5 timer.
      BEMÆRK: Under subkulturen alikvote 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamicin og en tilstrækkelig mængde PBS til alle vasketrin og anbringes i et 37 °C vandbad. Lad mediet nå 37 °C før brug.
  2. Overfør 2 x 108 CFU'er subkultureret Shigella til individuelle 2 ml mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: 2 x 108 CFU'er svarer til ca. 1 ml bakterieceller ved en OD600 på 0,7. Brug OD600-aflæsninger til at tilnærme CFU / ml i henhold til kalibreringen af hvert enkelt spektrofotometer.
  3. Vask Shigella-prøver 1x med PBS.
    1. Pilleceller ved centrifugering ved 17.000 x g i 2 min ved stuetemperatur. Supernatanten suges op, derefter tilsættes 1 ml varm PBS, og pelletsbrønden opslæmmes, idet prøven forsigtigt pipetteres op og ned, indtil blandingen er fuldstændig homogen (8-10x).
    2. Gentag trin 5.3.1. 1x ekstra tid.
    3. Pilleceller ved centrifugering ved 17.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur, opsuger supernatanten, og pellets resuspenderes i 2 ml varm DMEM.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af resuspenderede bakterier vil være 1 x 108 CFU/ml.
  4. Vortex, og derefter tilsættes 1 ml (1 x 108 CFU'er) resuspenderet Shigella plus 1 ml DMEM til hvert hul i de forberedte HT-29 colonepitelmonolag i 6-brøndsplader (fra trin 3.2.10.2).
    BEMÆRK: Infektioner udføres normalt ved en mangfoldighed af infektion (MOI; forholdet mellem bakterie- og epitelceller) på 100. For at teste forskellige MOI'er fortyndes resuspenderet Shigella i DMEM til den ønskede koncentration og tilsættes derefter 1 ml fortyndede bakterier til HT-29 monolag. For eksempel, for at teste en MOI på 10, fortynd bakterier 1:10 ved at tilføje 150 μL 1 x 108 CFU / ml bakterier til 1,35 ml DMEM, og tilsæt derefter 1 ml (1 x 107 CFU'er) til HT-29-celler.
  5. For at fremme bakteriel kontakt med HT-29-cellerne centrifugeres pladerne med 6 brønde ved 2.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur eller 37 °C, hvis temperaturindstillingen kan justeres.
    BEMÆRK: Centrifugering fremmer bakteriel kontakt med HT-29-cellerne, hvilket omgår behovet for vedhæftningsfaktorer og gør det muligt for bakterierne hurtigt at invadere cellerne.
  6. 6-brøndsplader inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 45 minutter.
  7. Under inkubationen bestemmes bakterieinfektiontiteren.
    1. Der fremstilles 10 gange serielle fortyndinger af resuspenderede Shigella-celler (fra trin 5.3.3) i PBS.
    2. Plade 100 μL af 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortyndingerne på TSB + Congo røde plader og inkuberes natten over ved 37 °C.
      BEMÆRK: Belægning af 100 μL fra 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortyndingerne svarer til en endelig fortyndingsfaktor på henholdsvis 1 x 10-6 og 1 x 10-7.
  8. Vask inficerede HT-29-celler grundigt 3x med 1 ml PBS.
    1. Aspirer medier fra hver brønd.
      BEMÆRK: Når du aspirerer medier fra 6-brøndplader, skal du føre spidsen af aspiratoren langs undersiden af brøndene og forsøge at undgå kontakt med HT-29-cellerne.
    2. Tilsæt 1 ml varm PBS til hver brønd og vask forsigtigt.
      BEMÆRK: For forsigtigt at vaske 6-brønds monolag med PBS skal du flytte pladen op og ned og side til side på bordpladen. Vask af plader i cirkulære bevægelser og / eller fjernelse af pladen fra bordpladens overflade kan forårsage mekanisk fjernelse af celler fra plast.
    3. Gentag trin 5.8.1 og 5.8.2 2x ekstra gange.
  9. PBS fjernes ved aspiration, tilsættes derefter 2 ml varm DMEM suppleret med 50 μg/ml gentamicin til hvert hul og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C med 5% CO2.
  10. Vask inficerede HT-29-celler grundigt 3x med 1 ml PBS.
    1. Gentag vasketrin 5.8.
  11. PBS fjernes ved aspiration, tilsæt derefter 2 ml varm DMEM suppleret med 50 μg/ml gentamicin til hvert hul og inkuber i 60 minutter ved 37 °C med 5% CO2.
  12. Vask inficerede HT-29-celler grundigt 3x med 1 ml PBS.
    1. Gentag vasketrin 5.8.
  13. PBS fjernes ved aspiration og lyser HT-29-celler ved at tilsætte 1 ml PBS + 1% Triton X-100 til hvert hul.
  14. Der inkuberes plader med 6 brønde ved 37 °C i 5 minutter.
  15. Brug en celleskraber eller en bøjet pipettespids til at skrabe de lyserede celler fra bunden af brønden og overføre hele 1 ml til et frisk 1,7 ml mikrocentrifugerør.
  16. Bestem antallet af intracellulære bakterier.
    1. Vortex hvert rør (fra trin 5.15) i mindst 30 s for yderligere at fortrænge Shigella fra de lyserede eukaryote celler.
    2. Forbered 10 gange serielle fortyndinger af lysater til PBS.
    3. Plade 100 μL af 1 x 10-2 og 1 x 10-3 fortyndingerne på TSB + Congo røde plader og inkuberes natten over ved 37 °C.
      BEMÆRK: Belægning af 100 μL fra 1 x 10-2 og 1 x 10-3 fortyndingerne svarer til en endelig fortyndingsfaktor på henholdsvis 1 x 10-3 og 1 x 10-4.

6. Intracellulær replikationsanalyse

BEMÆRK: Alle volumener er i overensstemmelse med et assay ved hjælp af to 6-brønds plader.

  1. Subkultur natten over Shigella kulturer via 1:50 fortynding til friske medier.
    1. Vortex, tilsæt derefter 100 μL af hver kultur natten over til 5 ml frisk TSB eller TSB + BS i et dyrkningsrør af passende størrelse.
      BEMÆRK: Begræns kulturvolumen til <20% af dyrkningskolben eller rørvolumen for at sikre korrekt beluftning.
    2. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 250 omdr./min., indtil cellerne når en OD600 på 0,7 (midterste logfase af Shigella-væksten ); ca. 2-2,5 timer.
      BEMÆRK: Under subkulturen alikvote 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamicin og en tilstrækkelig mængde PBS til alle vasketrin og anbringes i et 37 °C vandbad. Lad mediet nå 37 °C før brug.
  2. Overfør 2 x 108 CFU'er subkultureret Shigella til individuelle 2 ml mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: 2 x 108 CFU'er svarer til ca. 1 ml bakterieceller ved en OD600 på 0,7. Brug OD600-aflæsninger til at tilnærme CFU / ml i henhold til kalibreringen af hvert enkelt spektrofotometer.
  3. Vask Shigella-prøver 1x med PBS.
    1. Pilleceller ved centrifugering ved 17.000 x g i 2 min ved stuetemperatur. Supernatanten suges op, derefter tilsættes 1 ml varm PBS, og pelletsbrønden opslæmmes, idet prøven forsigtigt pipetteres op og ned, indtil blandingen er fuldstændig homogen (8-10x).
    2. Gentag trin 6.3.1. 1x ekstra tid.
    3. Pilleceller ved centrifugering ved 17.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur, opsuger supernatanten, og pellets resuspenderes i 2 ml varm DMEM.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af resuspenderede bakterier vil være 1 x 108 CFU/ml.
  4. Vortex, og derefter tilsættes 1 ml (1 x 108 CFU'er) resuspenderet Shigella plus 1 ml DMEM til hvert hul med forberedte HT-29 colonepitelmonolag i 6-brøndsplader (fra trin 3.2.10.2).
    BEMÆRK: Infektioner udføres normalt ved en mangfoldighed af infektion (MOI; forholdet mellem bakterie- og epitelceller) på 100. For at teste forskellige MOI'er fortyndes resuspenderet Shigella i DMEM til den ønskede koncentration og tilsættes derefter 1 ml fortyndede bakterier til HT-29 monolag. For eksempel, for at teste en MOI på 10, fortynd bakterier 1:10 ved at tilføje 150 μL 1 x 108 CFU / ml bakterier til 1,35 ml DMEM, og påfør derefter 1 ml (1 x 107 CFU'er) på HT-29-celler.
  5. For at fremme bakteriel kontakt med HT-29-cellerne centrifugeres pladerne med 6 brønde ved 2.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur eller 37 °C, hvis temperaturindstillingen kan justeres.
    BEMÆRK: Centrifugering fremmer bakteriel kontakt med HT-29-cellerne, hvilket omgår behovet for vedhæftningsfaktorer og gør det muligt for bakterierne hurtigt at invadere cellerne.
  6. 6-brøndsplader inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 45 minutter.
  7. Under inkubationen bestemmes bakterieinfektiontiteren.
    1. Der fremstilles 10 gange serielle fortyndinger af resuspenderede Shigella-celler (fra trin 6.3.3) i PBS.
    2. Plade 100 μL af 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortyndingerne på TSB + Congo røde plader og inkuberes natten over ved 37 °C.
      BEMÆRK: Belægning af 100 μL fra 1 x 10-5 og 1 x 10-6 fortyndingerne svarer til en endelig fortyndingsfaktor på henholdsvis 1 x 10-6 og 1 x 10-7.
  8. Vask inficerede HT-29-celler grundigt 3x med 1 ml PBS.
    1. Aspirer medier fra hver brønd.
      BEMÆRK: Når du aspirerer medier fra 6-brøndplader, skal du føre spidsen af aspiratoren langs undersiden af brøndene og forsøge at undgå kontakt med HT-29-cellerne.
    2. Tilsæt 1 ml varm PBS til hver brønd og vask forsigtigt.
      BEMÆRK: For forsigtigt at vaske 6-brønds monolag med PBS skal du flytte pladen op og ned og side til side på bordpladen. Vask af plader i cirkulære bevægelser og / eller fjernelse af pladen fra bordpladens overflade kan forårsage mekanisk fjernelse af celler fra plast.
    3. Gentag trin 6.8.1 og 6.8.2 2x ekstra gange.
  9. PBS fjernes ved aspiration, tilsættes derefter 2 ml varm DMEM suppleret med 50 μg/ml gentamicin til hvert hul og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C med 5% CO2.
  10. Vask inficerede HT-29-celler grundigt 3x med 1 ml PBS.
    1. Gentag vasketrin 6.8.
  11. PBS fjernes ved aspiration, derefter tilsættes 2 ml varm DMEM med 50 μg/ml gentamicin til hvert hul i 6-brøndpladerne og inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i det ønskede tidsrum for at muliggøre intracellulær replikation (op til 24 timer).
  12. Vask cellerne grundigt 2x med 1 ml PBS.
    1. Gentag vasketrin 6.8.
  13. PBS fjernes ved aspiration og lyser HT-29-celler ved at tilsætte 1 ml PBS + 1% Triton X-100 til hvert hul.
  14. Der inkuberes plader med 6 brønde ved 37 °C i 5 minutter.
  15. Brug en celleskraber eller bøjet pipettespids til at skrabe de lyserede celler fra bunden af brønden og overføre hele 1 ml til et frisk 1,7 ml mikrocentrifugerør.
  16. Bestem antallet af intracellulære bakterier.
    1. Vortex hvert rør (fra trin 6.15) i mindst 30 s for yderligere at fortrænge Shigella fra de lyserede eukaryote celler.
    2. Forbered 10 gange serielle fortyndinger af lysater til PBS.
    3. Plade 100 μL af 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortyndinger på TSB + Congo røde plader og inkuberes natten over ved 37 ° C.
      BEMÆRK: Belægning af 100 μL fra 1 x 10-2, 1 x 10-3 og 1 x 10-4 fortyndinger svarer til en endelig fortyndingsfaktor på henholdsvis 1 x 10-3, 1 x 10-4 og 1 x 10-5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Adhærens-, invasions- og intracellulære replikationsassays blev udført ved at sammenligne S. flexneri 2457T wild type (WT) med S. flexneri ΔVF (ΔVF), en mutant, der antages at regulere Shigella-virulens negativt. Da Shigella bruger galdesalte som et signal til at regulere virulens 17,18,47, blev eksperimenter udført efter bakteriel subkultur i TSB-medier samt TSB suppleret med 0,4% (w / v) galdesalte 18. Galdesalteksponering under subkulturtrinnet fungerer som en forbehandling for at replikere tyndtarmtransit før tyktarmsinfektion 17,18,47. Figur 1 analyserer effekten af ΔVF-mutationen på S. flexneris evne til at klæbe til HT-29 colonepitelceller. Procentvis adhærens er plottet på y-aksen og repræsenterer forholdet mellem genvundne bakterier efter HT-29-lysis standardiseret til antallet af inputbakterier. Som forventet havde både S. flexneri WT- og ΔVF-stammer en signifikant stigning i vedhæftning, når de blev subdyrket med galdesalttilskud sammenlignet med TSB uden galdesalttilskud18. Der var imidlertid ingen forskel i overholdelse af HT-29-celler mellem WT- og ΔVF-mutantstammer inden for hver subkulturtilstand. Disse data indikerer, at ΔVF-mutationen ikke har nogen effekt på S. flexneris evne til at klæbe til HT-29-epitelceller med eller uden galdesalte forbehandling.

I figur 2 blev effekten af ΔVF-mutationen på S. flexneris evne til at invadere (figur 2A) og replikere (figur 2B) inde i HT-29 colonepitelceller med eller uden galdesalte forbehandling analyseret. Procentvis genvinding er plottet på y-aksen og repræsenterer forholdet mellem genvundne bakterieceller efter HT-29-cellelyse standardiseret til antallet af inputbakterier. I figur 2A var der en forventet signifikant stigning i WT S. flexneri 2457T's evne til at invadere HT-29-celler efter præeksponering for galdesalte48, mens S. flexneri ΔVF-mutanten viste en mindre stigning i invasion efter galdesalte før eksponering sammenlignet med WT-stammen.  ΔVF-mutanten havde øget invasionshastigheder af HT-29-celler sammenlignet med WT-subkulturen i TSB, men havde lignende invasionshastigheder som WT, når den blev subkultureret i TSB suppleret med galdesalte (figur 2A). Disse resultater tyder på, at ΔVF-mutationen forbedrer S. flexneris evne til at invadere HT-29-celler, hvilket mindsker effekten af galdesaltene før eksponering, selvom ΔVF-mutantens invasionsevne steg yderligere efter galdesaltsubkultur.

Samlet set blev 10 gange flere bakterier genfundet efter inkubation natten over (figur 2B) sammenlignet med 90 minutters inkubation (figur 2A), hvilket viser forskellene i overvågning af intracellulær vækst versus invasion. Når inficerede HT-29-celler blev inkuberet i 18 timer for at muliggøre intracellulær replikation af bakterierne (figur 2B), faldt virkningen af galdesaltene forbehandling for både WT- og ΔVF-stammerne . Den reducerede virkning af galdesalte forbehandling under intracellulær replikation var imidlertid mere dramatisk for ΔVF-mutanten . Da stigningen i intracellulær replikation af begge stammer, når de blev udsat for galdesalte, var mindre end stigningen i invasionshastigheder under de samme forhold, antager vi, at galdesalte har større indflydelse på de tidlige trin i S. flexneri patogenese. ΔVF-mutanten viste en stigning i procentvis genopretning fra replikation natten over inde i HT-29-celler sammenlignet med WT (figur 2B) efter begge subkulturbetingelser. Imidlertid var de procentvise genvindinger af ΔVF-mutanten ens uanset galdesalte før eksponering. Disse datatendenser tyder på, at ΔVF-mutanten replikerer mere effektivt inde i HT-29-celler sammenlignet med WT, og at galdesalte før eksponering ikke påvirker ΔVF-mutantens evne til at replikere intracellulært, som observeret for WT (figur 2B). Da forskellen mellem mutant- og WT-stammerne i galdesaltene før eksponering ikke blev observeret under 90 minutters invasionsanalysen, antager vi, at produktet kodet af det slettede VF-gen også kan regulere S. flexneri-replikation inde i HT-29-celler. Tilsammen viser begge analyser, at ΔVF-mutanten er mere virulent i forhold til WT, hvilket tyder på, at VF-genproduktet er en negativ regulator af S. flexneri virulens.

Figure 1
Figur 1: Galdesalte før eksponering induceret adhærens af S. flexneri til HT-29-celler. S. flexneri 2457T WT og ΔVF mutantceller blev subkultureret i enten TSB eller TSB suppleret med 0,4% (w / v) galdesalte (TSB + BS) medier. Bakterierne blev derefter påført HT-29-celler ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 100 og inkuberet i 3 timer for at undersøge adhærens. Efter inkubation blev inficerede HT-29-celler vasket og lyseret, og serielle fortyndinger af genvundne bakterier blev belagt for at opregne kolonidannende enheder pr. ml (CFU / ml). Antallet af vedhængende bakterier plottes i forhold til inputbakterietiterne for at fastslå den procentvise vedhæftning. Data er repræsentative for en biologisk replikat med tre tekniske replikater (individuelle prikker). Fejlbjælker angiver standardfejlen for middelværdien (SEM). Statistisk signifikans blev bestemt af en studerendes t-test (*p < 0,05; ***p < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Galdesalte før eksponering øgede WT S. flexneri invasion og intracellulær replikation. S. flexneri 2457T WT og ΔVF mutantceller blev subkultureret i enten TSB eller TSB suppleret med galdesalte (TSB + BS) medier. Bakterierne blev derefter påført HT-29-celler ved en MOI på 100, centrifugeret på cellerne og inkuberet ved 37 °C med 5% CO2 i 45 minutter. Celler blev vasket med PBS, og ekstracellulære bakterier blev lyseret ved tilsætning af gentamicin til DMEM for udelukkende at genvinde intracellulære bakterier. Efter 90 min (A, bakteriel invasion) eller 18 timer (B, intracellulær replikation) inkubationer blev inficerede HT-29-celler vasket og lyseret, og serielle fortyndinger af genvundne bakterier blev belagt for at opregne kolonidannende enheder pr. ml (CFU / ml). Antallet af intracellulære bakterier plottes i forhold til inputbakterietiterne for at etablere den procentvise genvinding. Data er repræsentative for en biologisk replikat, hver med tre tekniske replikater (individuelle prikker). Fejlbjælker angiver SEM. Statistisk signifikans blev bestemt af en studerendes t-test (*p < 0,05). Bemærk forskellene i y-akseskalaerne mellem panelerne (A) og (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver et sæt af tre standardiserede assays til undersøgelse af Shigella-adhærens, invasion og intracellulær replikation af intestinale epitelceller. Selvom disse metoder kun er modificerede versioner af klassiske gentamicin-assays, der bruges til at studere invasionen og intracellulær replikation af forskellige bakterielle patogener i værtsceller 49,50,51, skal særlige overvejelser anvendes, når man studerer Shigella.

Shigella er fakultative anaerober, som vokser optimalt ved 37 °C i rigt medium med beluftning43. Når du udfører disse analyser for at undersøge virkningerne af forskellige miljøsignaler eller metabolitter på Shigella-infektioner, anbefales det at dyrke Shigella i rige medier natten over og derefter subkultur i definerede eller supplerede medier til midten af logfasen før infektion. Maksimal virulensgenekspression forekommer under den logaritmiske vækstfase52,53. Således er subkulturering natten over Shigella-kulturer og tillader bakterievækst til eksponentiel fase (OD600 ~ 0,7) nødvendige trin for korrekt vurdering af Shigella-virulens. Endvidere er virulensgenekspression temperaturafhængig. For kun at sikre specificitet for ekspression under værtsinfektion induceres virulensgener ved værtsfysiologiske temperaturer (37 °C) og undertrykkes strengt ved lavere temperaturer (f.eks. 30 °C)54. For at sikre ekspression af virulensgener skal bakteriel subkultur og infektioner udføres ved 37 °C med passende omhu for at sikre, at temperaturen ikke falder til under 37 °C. Et stort 220 kilobase virulensplasmid, der koder for det molekylære maskineri, der kræves til invasion og epitelcelleinfektion, er en essentiel virulensdeterminant for alle Shigella spp5. Gentagen passage og langvarig vækst ved 37 °C fremmer virulensplasmidustabilitet, hvilket resulterer i plasmidtab og gør Shigella-celler avirulent55. For at sikre virulensplasmidvedligeholdelse og ekspression af vigtige virulensgener anbefales det at restreak bakterier direkte fra fryselagre hver anden uge på friske TSB + Congo røde indikatorplader. Congo rød agar kan bruges til at skelne mellem vildtype virulente (røde, CR +) kolonier og avirulent (hvide, CR-) kolonier, der har mistet virulensplasmidet45. Hvis virulensplasmidustabilitet gentagne gange observeres, kan kulturer af Shigella natten over inkuberes ved 30 °C for at forhindre virulensplasmidtab efterfulgt af subkultur ved 37 °C for at fremme virulensgenekspression43. Endelig, hvis der udføres analyser med mutanter og / eller komplementerede stammer, hvor antibiotikamarkører er til stede i disse bakteriestammer, anbefales det at anvende den passende antibiotikaudvælgelse under de bakterielle overnatnings- og subkultureringstrin.

Anvendelsen af HT-29 epitelmonolag har mange fordele ved at studere de molekylære mekanismer af Shigella-patogenese in vitro. Da Shigella er et mennesketilpasset patogen, afspejler små dyremodeller ikke nøjagtigt den karakteristiske patogenese af shigellose observeret hos mennesker36. Således muliggør brugen af standardiserede protokoller til infektion af humanafledte cellelinjer kvantitativ forhør af individuelle trin i bakteriepatogenese for at karakterisere det molekylære samspil mellem dette patogen og dets oprindelige vært. Historisk set blev HeLa-celler overvejende brugt til at studere værtspatogeninteraktioner in vitro 25,56,57. HeLa-celler er imidlertid en udødeliggjort livmoderhalskræftcellelinje, som er ikke-indfødte værtsceller for enteriske bakterielle patogener. Således er in vitro-undersøgelser af enterisk patogenese skiftet til brugen af colon adenocarcinomcellelinjer (fx HT-29, Caco-2 og T84), som mere trofast rekapitulerer intestinal epitelmorfologi og kan dyrkes på transwells som epitelmonolag med differentierede apikale og basolaterale overflader 58,59,60. Selvom hver cellelinje har sine individuelle styrker og svagheder, anvendes HT-29-celler i de analyser, der er beskrevet her på grund af fænotypiske ligheder med intestinale enterocytter og robust ekspression af celleoverfladereceptorer og proinflammatoriske cytokiner 58,59,61. Imidlertid er hver af disse diskuterede modeller kræftafledte cellelinjer med afvigende metaboliske og vækstfænotyper, der ikke nøjagtigt repræsenterer den naturlige fysiologiske tilstand af tyktarmepitelet in vivo58. Nylige fremskridt inden for humane vævskulturteknikker har muliggjort dyrkning af humane tarmstamceller, opnået fra vævsbiopsier, til organoider eller enkelttodimensionale cellemonolag, der rekapitulerer de forskellige celletyper, der findes i den humane gastrointestinale (GI) kanal 62,63,64. Intestinale organoider kan differentieres til at omfatte enterocytter, slimproducerende bægerceller, M-celler og andre vævsspecifikke celletyper. Nylige undersøgelser har valideret brugen af disse organoidmodeller til undersøgelse af enteriske patogener, herunder forskellige Shigella spp., Salmonella enterica og Escherichia coli pathovars 62,63,64. Selvom organoider er mere nøjagtige modeller af det humane GI-epitel og endda kan dyrkes under forskellige næringsstofforhold for at repræsentere den globale befolkning65, kræver deres relative kompleksitet betydelig uddannelse og teknisk ekspertise, hvilket resulterer i højere omkostninger og længere dyrkningstider sammenlignet med traditionelle kræftcellelinjer58.

Denne protokol beskriver medium-throughput metoder, hvorved to 6-brønds plader anvendes til i alt 12 monolag, der er tilgængelige til test. Eksperimenter kan dog let skaleres for at øge antallet af monolag, der er podet for at imødekomme yderligere tekniske replikater, eller test af yderligere Shigella-mutanter og miljøsignaler. Vævskulturplader med flere brønde (f.eks. 12-brønds- eller 24-brøndplader) kan også bruges med passende justeringer for at tage højde for brønde med mindre diametre. Under HT-29-vækstbetingelserne skitseret i trin 3.2 er HT-29-titere tilstrækkelige til såning af ca. seks 6-brøndsplader efter dyrkning fra en T75-kolbe med nok resterende celler til at opretholde HT-29-cellekulturen. Endvidere er såning af HT-29 monolag og forberedelse af inokulerende bakterietrin identiske mellem bakteriel adhærens, invasion og intracellulære replikationsassays. Således kan assays, der tester de samme Shigella-stammer eller subkultureringsbetingelser, let udføres parallelt for samtidig at undersøge rollen som hver eksperimentel tilstand i forskellige trin af Shigella-infektion .

Genoprettelsestitre for klæbende (trin 4), invaderede (trin 5) og intracellulære bakterier (trin 6) bestemmes ved plettering af serielle fortyndinger af inficerede HT-29-celler efter lysis, hvilket muliggør kvantitativ vurdering af effektiviteten af hvert trin i Shigella-infektion. Centrifugeringstrinnene i invasions- og intracellulære replikationsassays, baseret på klassiske assays 49,50,51, fremmer bakteriel kontakt med værtscellerne til øjeblikkelig invasion og forbedrer invasionshastighederne. Således springer centrifugering "over" vedhæftningstrinnet, som senere blev opdaget at være et vigtigt aspekt af Shigella-infektion 17,18,19,66. Det er vigtigt at bemærke, at centrifugetrinnet ikke kan udføres med polariserede epitelceller podet på transwells. Til adhærensanalysen tvinges adhærens imidlertid ikke ved centrifugering, og der tilsættes ingen gentamicin til de inficerede HT-29-celler før lysis, hvilket tillader tælling af klæbende bakterieceller. Volumenet af vævskulturmedier reduceres til 1 ml (i modsætning til 2 ml til invasions- og intracellulære replikationsassays) for at muliggøre mere effektiv kontakt mellem bakterierne og HT-29-cellerne. Afhængigt af vedhæftningshastigheden kan der desuden forekomme en vis invasion og intracellulær replikation under 3 timers inkubation, men mængden er typisk ubetydelig (f.eks. Kun 0,05% af den genvundne bakteriepopulation efter værtscellelyse). For korrekt at redegøre for vedhængende versus intracellulære bakterier under 3 timers inkubation anbefales det ikke desto mindre at udføre parallelle assays, hvor der ud over den angivne protokol inkuberes en anden plade med 50 μg / ml gentamicin i 2 ml DMEM pr. Brønd i 45 minutter i alt (15 minutters inkubation, vask, frisk DMEM + gentamycin i 30 minutter) for grundigt at lyse ekstracellulære bakterier. Efter HT-29-cellelyse som nævnt i protokollen kan de intracellulære bakterier opregnes som nævnt ovenfor og vil repræsentere antallet af bakterier, der invaderede. Denne værdi kan derefter trækkes fra bakterierne opregnet fra pladen uden gentamicinbehandling for at bestemme klæbende og invaderede bakterier korrekt. Parallelle analyser kan også udføres for at give mere indsigt i den intracellulære replikation af Shigella inde i HT-29-celler efter invasion, f.eks. ved hjælp af flere tidspunkter til at udføre intracellulære vækstkurver. Endelig kan kultursupernatanterne sammen med optælling af intracellulære bakterier efter en 18 timers gentamicinin-inkubation indsamles og analyseres for cytokinsekretion af inficerede HT-29-celler. For eksempel er IL-8 en kemokin, der udskilles af epitelceller, der stort set fungerer til at rekruttere PMN'er til infektionsstedet. Mængden af IL-8, der udskilles i kulturmediet af inficerede HT-29-celler, kan analyseres med et IL-8 ELISA-assay67.

Galdesalte har vist sig at være et vigtigt virulenssignal for Shigella under transit gennem det humane GI-system og kan bruges til at supplere bakterielle vækstmedier i disse protokoller for at replikere typiske GI-forhold. Naturligvis indføres galdesalte i tolvfingertarmen eller den øvre del af tyndtarmen for at hjælpe med fordøjelsen; Og i det terminale ileum eller enden af tyndtarmen fjernes 95% af galdesaltene og genbruges tilbage i omløb for ultimativ deponering i galdeblæren68. Galdesalte har normalt en koncentration mellem 0,2% -2,0% (w / v) i tyndtarmen og er naturligt bakteriedræbende. Imidlertid modstår Shigella, sammen med de fleste enteriske bakterier, galdesalte og bruger signalerne til at forbedre infektion47. Flere undersøgelser har dokumenteret, hvordan galdesalte eksponering, til tider i forbindelse med andre tyndtarmssignaler som glukose, påvirker Shigella overlevelse og virulensregulering før infektion. Shigella har vist sig at modstå galdesalte, ændre genekspression og danne og sprede en biofilm under forhold, der reproducerer tyndtarmtransit 17,69. Undersøgelserne har vist, at disse ændringer resulterer i en hypervirulent fænotype, hvor adhærens og invasion induceres ved efterfølgende coloninfektion med Shigella 17,18,19,48,66. Således dokumenterer de ovenfor skitserede betingelser, hvordan man subkulturerer Shigella i galdesalte for at efterligne tyndtarmtransit, inden der udføres vedhæftnings-, invasions- eller intracellulære replikationsassays. Den specificerede TSB-formulering indeholder tilsat glucose i forhold til typisk Luria bouillon (LB)17. Hvis LB anvendes, er det derfor vigtigt også at supplere mediet med glukose (0,5% -2,0% [w/v]) for at tage behørigt hensyn til glukosesignalerne i tyndtarmen17. Desuden vaskes alle Shigella-subkulturer, som nævnt ovenfor, for at fjerne galdesalte og efterligne overgangen til tyktarmen til infektionsanalyser.

Traditionelt, og som fremhævet i resultaterne ovenfor (figur 1 og figur 2), er infektionsanalyser værdifulde for at bestemme rollen af et bestemt gen i Shigella-infektion . Fænotypen af forskellige mutanter kan dog ikke virkelig værdsættes uden korrekt tilskud af bakteriekulturmediet. Som tidligere forskning har vist, ændrer galdesalte signifikant S. flexneri genekspression, herunder gener for central metabolisme, transkriptionsfaktorer, sukkertransportører, lægemiddelresistens og virulensgener, der enten er kodet på kromosomet eller virulensplasmidet17. Disse gener giver indsigt i, hvordan Shigella bruger galdesalte som et signal til at ændre genekspression og forberede sig på eventuel infektion i tyktarmen, og efterfølgende mutationsanalyser skal derfor udføres i de passende supplerede bakterielle vækstmedier, inden man undersøger virkninger på virulens i adhærens-, invasions- og intracellulære replikationsassays. Som det ses ovenfor i figur 1 og figur 2, påvirkede ΔVF-mutationen ikke adhærens, men påvirkede invasion og intracellulær replikation. Siden mutationen forbedrede invasion og intracellulær replikation, eksperimenter er i øjeblikket i gang for at bestemme, hvordan genproduktet regulerer infektion. De mutante analyser tjener som et eksempel på, hvordan nye forståelser i Shigella patogenese kan studeres, især under forhold, der bedre replikerer den menneskelige mave-tarmkanal. Korrekte komplementationsanalyser anbefales for at validere fænotyperne af forskellige mutanter.

I kombination beskriver disse procedurer kvantitative eksperimenter, der vil give vigtig indsigt i de molekylære mekanismer for Shigella-vedhæftning, invasion af og replikation inde i HT-29 colonepitelceller ved bedst at efterligne det naturlige miljø i den humane mave-tarmkanal under infektion. Fremtidige undersøgelser kan udvide mutanterne og eksperimentelle forhold for at få en bedre forståelse af, hvordan Shigella forbereder sig på og effektivt inficerer menneskelige værter. På trods af årtiers forskning er der stadig så meget mere at opdage om Shigella-infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Støtte til forfatterne inkluderer Massachusetts General Hospitals afdeling for pædiatri, Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF) -prisen 2022A009041, National Institute of Allergy and Infectious Diseases grant R21AI146405 og National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant Nutrition Obesity Research Center ved Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller udarbejdelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Tags

Immunologi og infektion udgave 204 Shigella adhærens invasion intracellulær replikation patogenese virulensfaktorer epitelceller galdesalte
Epitelcelleinfektionsanalyser med <em>Shigella</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, … More

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter