Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Infektionsassays zur Abfrage der Shigella-Adhärenz, -Invasion und -intrazellulären Replikation unter Verwendung von In-vitro-Epithelzelllinien.
Abstract
Der an den Menschen angepasste bakterielle Erreger Shigella verursacht jedes Jahr Millionen von Infektionen, erzeugt langfristige Wachstumseffekte bei pädiatrischen Patienten und ist weltweit eine der Hauptursachen für Durchfalltode. Eine Infektion führt zu wässrigem oder blutigem Durchfall, da der Erreger den Magen-Darm-Trakt durchquert und die Epithelzellen infiziert, die den Dickdarm auskleiden. Angesichts der erschütternden Zunahme von Antibiotikaresistenzen und des derzeitigen Mangels an zugelassenen Impfstoffen sind standardisierte Forschungsprotokolle für die Untersuchung dieses gewaltigen Erregers von entscheidender Bedeutung. Hier werden Methoden vorgestellt, um die molekulare Pathogenese von Shigella anhand von In-vitro-Analysen der bakteriellen Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation in Dickdarmepithelzellen zu untersuchen. Vor Infektionsanalysen wurde der Virulenzphänotyp der Shigella-Kolonien durch die Aufnahme des Kongorotfarbstoffs auf Agarplatten verifiziert. Supplementierte Labormedien können auch während der Bakterienkultivierung in Betracht gezogen werden, um In-vivo-Bedingungen nachzuahmen. Bakterienzellen werden dann in einem standardisierten Protokoll verwendet, um Dickdarmepithelzellen in Gewebekulturplatten bei einer etablierten Infektionsvielfalt mit Anpassungen zur Analyse jedes Infektionsstadiums zu infizieren. Für Adhärenz-Assays werden Shigella-Zellen mit reduzierten Medienkonzentrationen inkubiert, um den bakteriellen Kontakt mit Epithelzellen zu fördern. Sowohl für Invasions- als auch für intrazelluläre Replikationsassays wird Gentamicin in verschiedenen Zeitintervallen angewendet, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren und die Beurteilung der Invasion und/oder die Quantifizierung intrazellulärer Replikationsraten zu ermöglichen. Alle Infektionsprotokolle zählen adhärente, eingedrungene und/oder intrazelluläre Bakterien auf, indem infizierte Epithelzelllysate seriell verdünnt und bakterielle koloniebildende Einheiten relativ zu den Infektionstitern auf Kongo-Rotagarplatten plattiert werden. Zusammen ermöglichen diese Protokolle eine unabhängige Charakterisierung und Vergleiche für jedes Stadium der Shigella-Infektion von Epithelzellen, um diesen Erreger erfolgreich zu untersuchen.
Introduction
Durchfallerkrankungen, die durch bakterielle Krankheitserreger verursacht werden, sind eine erhebliche globale Gesundheitsbelastung. Im Jahr 2016 waren Durchfallerkrankungen weltweit für 1,3 Millionen Todesfälle verantwortlich und waren die vierthäufigste Todesursache bei Kindern unter fünf Jahren 1,2. Der gramnegative, enterische bakterielle Erreger Shigella ist der Erreger der Shigellose, einer der Hauptursachen für Durchfalltodesfälle weltweit3. Shigellose verursacht jedes Jahr eine signifikante Morbidität und Mortalität bei Kindern aus Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen 4,5, während Infektionen in Ländern mit hohem Einkommen mit Ausbrüchen in Kindertagesstätten, lebensmittelbedingten und wasserbedingten Ausbrüchen zusammenhängen 6,7,8,9. Die ineffektive Entwicklung von Impfstoffen 10 und die steigenden Raten von Antibiotikaresistenzen (AMR)11,12 haben das Management von großflächigen Shigella-Ausbrüchen erschwert. Jüngste Daten der Centers for Disease Control and Prevention zeigen, dass fast 46 % der Shigella-Infektionen in den Vereinigten Staaten im Jahr 2020 eine Arzneimittelresistenz aufwiesen13,14, während die Weltgesundheitsorganisation Shigella zu einem vorrangigen AMR-Erreger erklärt hat, für den dringend neue Therapien benötigt werden15.
Shigella-Infektionen werden leicht über den fäkal-oralen Weg übertragen, wenn kontaminierte Lebensmittel oder Wasser aufgenommen werden, oder durch direkten menschlichen Kontakt. Shigella hat sich zu einem effizienten, an den Menschen angepassten Krankheitserreger entwickelt, mit einer infektiösen Dosis von 10-100 Bakterien, die ausreicht, um Krankheiten zu verursachen16. Während der Dünndarmpassage ist Shigella Umweltsignalen wie erhöhter Temperatur und Galleausgesetzt 17. Der Nachweis dieser Signale induziert transkriptionelle Veränderungen, um Virulenzfaktoren zu exprimieren, die die Fähigkeit der Bakterien verbessern, den menschlichen Dickdarm zu infizieren 17,18,19. Shigella dringt nicht von der apikalen Oberfläche in das Dickdarmepithel ein, sondern durchquert die Epithelschicht und folgt der Aufnahme in spezialisierte antigenpräsentierende Mikrofaltenzellen (M-Zellen) innerhalb des follikelassoziierten Epithels 20,21,22. Nach der Transzytose werden Shigella-Zellen von residenten Makrophagen phagozytiert. Shigella entkommt schnell dem Phagosom und löst den Zelltod der Makrophagen aus, was zur Freisetzung von entzündungsfördernden Zytokinen führt 5,23,24. Shigella dringt dann von der basolateralen Seite in Dickdarmepithelzellen ein, lysiert die makropinozytäre Vakuole und etabliert eine replikative Nische im Zytoplasma 5,25. Proinflammatorische Zytokine, insbesondere Interleukin-8 (IL-8), rekrutieren polymorphkernige neutrophile Leukozyten (PMNs) an den Ort der Infektion, was die epithelialen Tight Junctions schwächt und eine bakterielle Infiltration der Epithelaushaut ermöglicht, um die basolaterale Infektion zu verschlimmern5. Die PMNs zerstören die infizierte Epithelschleimhaut, um die Infektion einzudämmen, was zu den charakteristischen Symptomen einer bazillären (blutigen) Ruhr führt5. Obwohl die Invasions- und intrazellulären Replikationsmechanismen gründlich charakterisiert wurden, zeigen neue Forschungsergebnisse wichtige neue Konzepte bei Shigella-Infektionen, einschließlich der Virulenzregulation während des gastrointestinalen (GI) Transits17, der Adhärenz19, des verbesserten basolateralen Zugangs durch Barrierepermeabilität26 und der asymptomatischen Übertragung bei unterernährten Kindern27.
Die Fähigkeit von Shigella spp., Durchfallerkrankungen zu verursachen, ist auf Menschen und nicht-menschliche Primaten (NHP) beschränkt28. Shigella-Darminfektionsmodelle wurden für Zebrafische29, Mäuse30, Meerschweinchen31, Kaninchen21, 32, 33 und Schweine34, 35 entwickelt. Keines dieser Modellsysteme kann jedoch die während einer menschlichen Infektion beobachteten Krankheitsmerkmale genau reproduzieren36. Obwohl NHP-Modelle der Shigellose zur Untersuchung der Shigella-Pathogenese etabliert wurden, sind diese Modellsysteme teuer in der Implementierung und erfordern künstlich hohe infektiöse Dosen, die bis zu neun Größenordnungen höher sind als die infektiöse Dosis des Menschen 37,38,39,40,41,42. Daher erfordert die bemerkenswerte Anpassung von Shigella an die Infektion menschlicher Wirte die Verwendung von Zellkulturen menschlichen Ursprungs, um physiologisch relevante Modelle für eine genaue Untersuchung der Shigella-Pathogenese zu erstellen.
Hier werden detaillierte Verfahren beschrieben, um die Raten der Shigella-Adhärenz, Invasion und Replikation innerhalb von HT-29-Dickdarmepithelzellen zu messen. Mit diesen standardisierten Protokollen können die molekularen Mechanismen, durch die bakterielle Virulenzgene und Umweltsignale jeden Schritt der Shigella-Infektion beeinflussen, untersucht werden, um die dynamische Wirt-Pathogen-Interaktionsbeziehung besser zu verstehen.
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Protocol
1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien
HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.
- TSB-Medium: 0,5 l deionisiertes (DI) Wasser zu 15 g Medium Tryptische Sojabrühe (TSB, siehe Materialtabelle) geben und autoklavieren. Bei Raumtemperatur lagern.
- Gallensalzmedium (TSB + BS): Zur Herstellung von TSB mit 0,4 % (w/v) Gallensalzen werden 0,06 g Gallensalze (BS, siehe Materialtabelle) in 15 ml autoklaviertem TSB resuspendiert. Filtersterilisation mit einem 0,22 μm PES-Filter.
HINWEIS: Die Gallensalze bestehen aus einer 1:1-Mischung aus Natriumcholat und Natriumdesoxycholat. Bereiten Sie frische Medien unmittelbar vor der Verwendung vor. - DMEM + 10% (v/v) FBS: Fügen Sie 5 ml fötales Kälberserum (FBS) zu 45 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu. Bei 4 °C lagern.
- DMEM + Gentamicin: Geben Sie 50 ml DMEM und 50 μl 50 mg/ml Gentamicin in ein 50-ml-Röhrchen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Vor jedem Versuch frisches Aliquot herstellen und in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. - PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Fügen Sie 150 μl Triton X-100 zu 15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu.
HINWEIS: Vor jedem Versuch frisches Aliquot herstellen und in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. - TSB + Kongorot-Indikatorplatten: Geben Sie 15 g TSB, 7,5 g ausgewähltes Agar und 0,125 g Kongorotfarbstoff (siehe Materialtabelle) in eine 1-Liter-Flasche. 0,5 l DI-Wasser hinzufügen und autoklavieren. Gießen Sie 10-20 ml Medium in einzelne sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) und lassen Sie es erstarren.
ACHTUNG: Kongorot ist krebserregend und ein Fortpflanzungsgift. Stellen Sie sicher, dass der Umgang mit Kongorot mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung erfolgt. Weitere Informationen finden Sie im Produktsicherheitsdatenblatt.
HINWEIS: Ungefähr 20 Teller werden aus 0,5 l kongolesischen roten Medien hergestellt. Die Teller können 2-3 Tage im Voraus zubereitet und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur umgedreht belassen werden. Für die Langzeitlagerung Lege umgedrehte Platten bis zu 3 Monate bei 4 °C in Kunststoffhüllen. - DMEM + 10% (v/v) FBS und 5% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO): Geben Sie 42,5 ml DMEM, 5 ml FBS und 2,5 ml DMSO in ein 50-ml-Röhrchen. Bei 4 °C lagern.
2. Vorbereitung von Bakterien
HINWEIS: Alle Shigella-Laborkultivierungs - und Lagerungsprotokolle wurden von Payne, S. M.43 übernommen.
ACHTUNG: Shigella spp. sind Erreger der Risikogruppe 244. Führen Sie alle Laborarbeiten in einer BSL-2-Umgebung durch, wobei zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen ergriffen werden, um versehentliche Expositionen aufgrund der niedrigen infektiösen Dosis von Shigella spp. zu begrenzen.
- Wachstum von Shigella aus Tiefkühlbeständen
- Übertragen Sie eine kleine Menge gefrorener Kultur aus dem kryogenen Fläschchen mit einem sterilen Applikator auf eine TSB + Kongo-Rotagarplatte.
- Flammsterilisieren Sie eine Impfschlaufe und lassen Sie sie abkühlen. Streifen Sie das Inokulum über einen Quadranten der Platte hin und her. Entflammen Sie die Schlaufe, lassen Sie sie abkühlen und streifen Sie dann vom ersten Quadranten auf den zweiten Quadranten der Platte. Wiederholen Sie den Vorgang, um das Inokulum in den dritten und vierten Quadranten der Platte zu streifen.
HINWEIS: Alternativ können Sie das Inokulum mit einem frischen sterilen Applikator zwischen den einzelnen Quadranten streifen. - Die Platte umdrehen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Für die Expression von Shigella-Virulenzfaktoren , die für die Beobachtung des Kongo-Rot-positiven (CR+) Phänotyps45 erforderlich sind, ist eine Inkubation bei Temperaturen ≥37 °C erforderlich. Avirulente Kolonien haben ein weißes Aussehen und sind nicht invasiv. - Die Platte mit Paraffinfolie verschließen und gekühlt bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Bakterienkolonien bleiben auf Agarplatten 1-2 Wochen lebensfähig.
- Wachstum von Shigella über Nacht in Flüssigkultur
- Aliquotieren Sie 3 ml TSB-Medien in sterile 14-ml-Kulturröhrchen.
- Wählen Sie eine einzelne, gut isolierte rote (CR+) Kolonie mit einem sterilen Applikator und resuspendieren Sie sie in flüssigen Medien.
- Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht (16-18 h) bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 250 Umdrehungen pro Minute (U/min).
3. Herstellung von eukaryotischen HT-29-Zellen
HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein. HT-29-Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben. Die HT-29-Wartungsprotokolle wurden von den ATCC-Empfehlungen46 übernommen. Alle Medien sollten vor der Verwendung in einem Wasserbad bei 37 °C vorgewärmt werden. Alle HT-29-Wartungsprotokolle sollten in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Mischen/Arbeiten mit HT-29-Zellen in Medien, um dramatische pH-Änderungen zu vermeiden.
- Auftauen von HT-29-Zellen aus gefrorenem Bestand
- Tauen Sie die Durchstechflasche mit HT-29-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Kappe vollständig über dem Wasser bleibt, um eine Kontamination zu vermeiden. Das Auftauen sollte weniger als 2 Minuten dauern. - Nehmen Sie das Fläschchen sofort nach dem vollständigen Auftauen der Kultur aus dem Wasser und dekontaminieren Sie es mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, dass alle Schritte ab diesem Zeitpunkt mit aseptischen Techniken durchgeführt werden.
- Geben Sie den gesamten Inhalt der Durchstechflasche in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 9 ml DMEM + 10 % FBS. Bei 125 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Dekantieren Sie den Überstand in einen Abfallbehälter und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml warmem DMEM + 10% FBS. Resuspendierte Zellen werden in einen 75 cm2 Gewebekulturkolben (T75) mit 10 ml warmem DMEM + 10 % FBS (Gesamtvolumen von 20 ml) überführt.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2 , bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen (ca. 6-7 Tage).
HINWEIS: Die Konfluenz wird durch visuelle Annäherung geschätzt.
- Tauen Sie die Durchstechflasche mit HT-29-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
- Aussaat von HT-29-Zellen
- 20 ml PBS und 50 ml DMEM + 10 % FBS in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen und 3 ml 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA auf Raumtemperatur vorwärmen.
- Sobald die HT-29-Zellen (aus Schritt 3.1) eine Konfluenz von 90 % erreicht haben, wird das HT-29-Zellkulturmedium aus dem T75-Kolben in einen Abfallbehälter umgefüllt. Gießen Sie ~10 ml warmes PBS in den Kolben und schwenken Sie ihn vorsichtig zum Waschen. Dekantieren Sie das PBS in einen Abfallbehälter. Nochmals mit warmem PBS waschen und dekantieren.
- Fügen Sie 2-3 ml 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA hinzu und schwenken Sie es vorsichtig über die gesamte Oberfläche. Bei 37 °C mit 5 % CO2 4 min inkubieren.
- Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und schwenken Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig, um sicherzustellen, dass sich alle Zellen von der Oberfläche lösen.
- Fügen Sie sofort 6 ml warmes DMEM + 10% FBS hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren. Piptieren Sie auf und ab, um gründlich zu mischen.
- Den gesamten Inhalt in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und bei 500 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur schleudern.
- Überstand vorsichtig in einen Abfallbehälter umfüllen und das Pellet in 6 ml warmem DMEM + 10 % FBS resuspendieren.
- Unmittelbar nach der Resuspension werden 10 μl suspendierte HT-29-Zellen aus der Mitte der Kultur in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen überführt. Geben Sie 10 μl Trypanblau-Farbstoff in das PCR-Röhrchen und mischen Sie.
- Geben Sie 10 μl HT-29-Zell-/Trypanblau-Mischung in einen Einweg-Countess-Zell-Gegenkammerobjektträger (siehe Materialtabelle). Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf und berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen.
HINWEIS: Wenn Sie die Anzahl der Zellen in der Stichprobe dokumentieren, lesen Sie die Zahl unter der "Live"-Zellzahl, nicht die Gesamtzellenzahl. Alternativ kann die Zellzählung manuell mit einem Hämozytometer durchgeführt werden. - Resuspendierte HT-29-Zellen in einen frischen T75-Kolben oder eine 6-Well-Platte.
- Für T75-Kolben:
- Zum Mischen vorsichtig pipettieren, dann 2,5 x 106 Zellen gemäß der folgenden Gleichung in einen frischen T75-Kolben umfüllen:
- Fügen Sie warmes DMEM + 10% FBS-Medium zu einem Endvolumen von 20 ml hinzu (Endkonzentration von 1,25 x 105 Zellen/ml).
- Die Zellen werden gleichmäßig über den Kolben verteilt, indem sie sanft hin und her geschaukelt werden.
- Bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.
HINWEIS: Für ein optimales Wachstum ersetzen Sie das DMEM + 10% FBS-Medium im T75-Kolben alle ~3 Tage. Dekantieren Sie das Medium in einen Abfallbehälter und geben Sie 10 ml warmes PBS in den Kolben. Schwenken Sie das PBS vorsichtig herum und füllen Sie es in den Abfallbehälter um. Dann 20 ml frisches, warmes DMEM + 10 % FBS in den Kolben geben und in den 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator zurückgeben.
- Zum Mischen vorsichtig pipettieren, dann 2,5 x 106 Zellen gemäß der folgenden Gleichung in einen frischen T75-Kolben umfüllen:
- Für 6-Well-Platte:
- Pipettieren Sie vorsichtig zum Mischen und übertragen Sie dann 5,85 x 106 Zellen gemäß der folgenden Gleichung in ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen:
- Fügen Sie warmes DMEM + 10% FBS-Medium zu einem Endvolumen von 26 ml hinzu (Endkonzentration von 2,25 x 105 Zellen/ml).
- Pipettieren Sie vorsichtig zum Mischen und geben Sie dann 2 ml (4,5 x 105 Zellen) in einzelne Wells mit 6-Well-Platten.
- Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig über die Vertiefung, indem Sie 2-3x sanft nach oben/unten und links/rechts schaukeln.
- Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 , bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 95 % erreichen (ca. 3-4 Tage).
HINWEIS: Für Invasions- und intrazelluläre Replikationsassays wird eine Konfluenz von 85 % empfohlen, während für Adhärenzassays eine Konfluenz von 90 % bis 95 % empfohlen wird. Die Zellen sollten nach 48 h Inkubation eine Konfluenz von ~85% erreichen, mit einer Endkonzentration von ca. 1 x 106 Zellen/Well. Anpassungen der Anzahl der ausgesäten Zellen und der Inkubationsdauer können erforderlich sein.
- Pipettieren Sie vorsichtig zum Mischen und übertragen Sie dann 5,85 x 106 Zellen gemäß der folgenden Gleichung in ein frisches konisches 50-ml-Röhrchen:
- Für T75-Kolben:
- Herstellung von gefrorenen HT-29-Beständen
- Aliquotieren Sie 1 ml DMEM + 10 % FBS + 5 % DMSO-Medien in einzelne kryogene Fläschchen.
- Geben Sie 1 x 106 HT-29-Zellen aus Schritt 3.2.7 in jede Durchstechflasche. Berechnen Sie das Volumen der Zellen gemäß der folgenden Formel:
- Lagern Sie HT-29-Zellen langfristig unter -130 °C im Flüssigstickstoffdampf-Lagergefrierschrank.
4. Adhärenz-Assay
HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.
- Subkultur über Nacht Shigella-Kulturen durch 1:50-Verdünnung in frische Medien.
- Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
Anmerkungen: Begrenzen Sie das Kulturvolumen auf <20 % des Kulturkolben- oder Röhrchenvolumens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten. - Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 250 U/min, bis die Zellen eine optische Dichte (OD600) von 0,7 erreichen (Mid-Log-Phase des Shigella-Wachstums ); ca. 2-2,5 h.
HINWEIS: Aliquotieren Sie während der Subkultur 50 ml DMEM und eine ausreichende Menge PBS für alle Waschschritte und legen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad. Lassen Sie das Medium vor der Verwendung 37 °C erreichen.
- Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
- Übertragen Sie 2 x 108 koloniebildende Einheiten (KBE) subkultivierte Shigellen in einzelne 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: 2 x 108 KBE entsprechen ungefähr 1 ml Bakterienzellen bei einem OD600 von 0,7. Verwenden Sie OD600-Messwerte , um die KBE/ml entsprechend der Kalibrierung jedes einzelnen Spektralphotometers anzunähern. - Waschen Sie jede Shigella-Probe 2x mit PBS.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie dann 1 ml warmes PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, indem Sie die Probe vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Mischung vollständig homogen ist (8-10x).
- Wiederholen Sie Schritt 4.3.1 1x weitere Zeit.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, den Überstand absaugen und die Pellets in 2 ml warmem DMEM resuspendieren.
HINWEIS: Die Endkonzentration der resuspendierten Bakterien beträgt 1 x 108 KBE/ml.
- Vortex, dann 1 ml (1 x 108 KBE) resuspendierte Shigella in jede Vertiefung der vorbereiteten HT-29-Dickdarmepithel-Monoschichten in 6-Well-Platten geben (aus Schritt 3.2.10.2).
HINWEIS: Infektionen werden normalerweise bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI; Verhältnis von Bakterien- zu Epithelzellen) von 100 durchgeführt. Um verschiedene MOIs zu testen, verdünnen Sie resuspendierte Shigella in warmem DMEM auf die gewünschte Konzentration und fügen Sie dann 1 ml verdünnte Bakterien zu HT-29-Monoschichten hinzu. Um beispielsweise einen MOI von 10 zu testen, verdünnen Sie Bakterien 1:10, indem Sie 150 μl 1 x 108 KBE/ml-Bakterien zu 1,35 ml warmem DMEM hinzufügen und dann 1 ml (1 x 107 KBE) auf HT-29-Zellen auftragen. - Inkubieren Sie die 6-Well-Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 für 3 h.
- Bestimmen Sie während der Inkubation den bakteriellen Infektionstiter.
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von resuspendierten Shigella-Zellen (aus Schritt 4.3.3) in PBS vor.
- 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-6 bzw. 1 x 10-7.
- Waschen Sie die Monolayer nach der Inkubation 4-5x mit PBS.
- Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
HINWEIS: Führen Sie beim Ansaugen von Medien aus 6-Well-Platten die Spitze des Aspirators entlang der Unterseite der Wells und versuchen Sie, den Kontakt mit den HT-29-Zellen zu vermeiden. - Geben Sie 1 ml warmes PBS in jede Vertiefung und waschen Sie es vorsichtig.
Anmerkungen: Um 6-Well-Monolayer sanft mit PBS zu waschen, bewegen Sie die Platte auf und ab und von Seite zu Seite auf der Tischplatte. Das Waschen von Platten in kreisenden Bewegungen und/oder das Entfernen der Platte von der Tischoberfläche kann dazu führen, dass Zellen mechanisch aus Kunststoff entfernt werden. - Wiederholen Sie die Schritte 4.7.1 und 4.7.2 4x weitere Male.
- Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
- Entfernen Sie PBS durch Aspiration und lysieren Sie HT-29-Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% Triton X-100 in jede Vertiefung geben.
- Inkubieren Sie 6-Well-Platten bei 37 °C für 5 Minuten.
- Verwenden Sie einen Zellschaber oder eine gebogene Pipettenspitze, um die lysierten Zellen vom Boden der Vertiefung abzukratzen und die vollen 1 ml in ein frisches 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
- Bestimmen Sie die Anzahl der zellassoziierten Bakterien.
- Wirbeln Sie jedes Röhrchen (aus Schritt 4.10) mindestens 30 s lang, um Shigella weiter aus den lysierten eukaryotischen Zellen zu verdrängen.
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von Lysaten in PBS vor.
- 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 entspricht einem endgültigen Verdünnungsfaktor von 1 x 10-3, 1 x 10-4 bzw. 1 x 10-5.
5. Invasions-Assay
HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.
- Subkultur über Nacht Shigella-Kulturen durch 1:50-Verdünnung in frische Medien.
- Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
Anmerkungen: Begrenzen Sie das Kulturvolumen auf <20 % des Kulturkolben- oder Röhrchenvolumens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten. - Bei 37 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren, bis die Zellen einen OD600 von 0,7 erreichen (Mid-Log-Phase des Shigella-Wachstums ); ca. 2-2,5 h.
HINWEIS: Während der Subkultur aliquotieren Sie 50 ml DMEM + 50 mg/ml Gentamicin und eine ausreichende Menge PBS für alle Waschschritte und legen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad. Lassen Sie das Medium vor der Verwendung 37 °C erreichen.
- Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
- 2 x 108 KBE, subkultivierte Shigella in einzelne 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
HINWEIS: 2 x 108 KBE entsprechen ungefähr 1 ml Bakterienzellen bei einem OD600 von 0,7. Verwenden Sie OD600-Messwerte , um die KBE/ml entsprechend der Kalibrierung jedes einzelnen Spektralphotometers anzunähern. - Shigella-Proben 1x mit PBS waschen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie dann 1 ml warmes PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, indem Sie die Probe vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Mischung vollständig homogen ist (8-10x).
- Wiederholen Sie Schritt 5.3.1. 1x zusätzliche Zeit.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, den Überstand absaugen und die Pellets in 2 ml warmem DMEM resuspendieren.
HINWEIS: Die Endkonzentration der resuspendierten Bakterien beträgt 1 x 108 KBE/ml.
- Vortex, dann 1 ml (1 x 108 KBE) resuspendierte Shigella plus 1 ml DMEM in jede Vertiefung der vorbereiteten HT-29-Dickdarmepithel-Monoschichten in 6-Well-Platten (aus Schritt 3.2.10.2).
HINWEIS: Infektionen werden normalerweise bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI; Verhältnis von Bakterien- zu Epithelzellen) von 100 durchgeführt. Um verschiedene MOIs zu testen, verdünnen Sie resuspendierte Shigellen in DMEM auf die gewünschte Konzentration und fügen Sie dann 1 ml verdünnte Bakterien zu HT-29-Monoschichten hinzu. Um beispielsweise einen MOI von 10 zu testen, verdünnen Sie Bakterien 1:10, indem Sie 150 μl 1 x 108 KBE/ml-Bakterien zu 1,35 ml DMEM hinzufügen und dann 1 ml (1 x 107 KBE) zu HT-29-Zellen hinzufügen. - Um den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen zu fördern, zentrifugieren Sie die 6-Well-Platten bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur oder 37 °C, wenn die Temperatureinstellung angepasst werden kann.
HINWEIS: Die Zentrifugation fördert den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen, wodurch die Notwendigkeit von Adhärenzfaktoren umgangen wird und die Bakterien schnell in die Zellen eindringen können. - 6-Well-Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 45 min inkubieren.
- Bestimmen Sie während der Inkubation den bakteriellen Infektionstiter.
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von resuspendierten Shigella-Zellen (aus Schritt 5.3.3) in PBS vor.
- 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-6 bzw. 1 x 10-7.
- Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
- Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
HINWEIS: Führen Sie beim Ansaugen von Medien aus 6-Well-Platten die Spitze des Aspirators entlang der Unterseite der Wells und versuchen Sie, den Kontakt mit den HT-29-Zellen zu vermeiden. - Geben Sie 1 ml warmes PBS in jede Vertiefung und waschen Sie es vorsichtig.
Anmerkungen: Um 6-Well-Monolayer sanft mit PBS zu waschen, bewegen Sie die Platte auf und ab und von Seite zu Seite auf der Tischplatte. Das Waschen von Platten in kreisenden Bewegungen und/oder das Entfernen der Platte von der Tischoberfläche kann dazu führen, dass Zellen mechanisch aus Kunststoff entfernt werden. - Wiederholen Sie die Schritte 5.8.1 und 5.8.2 2x weitere Male.
- Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
- PBS durch Aspiration entfernen, dann 2 ml warmes DMEM, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin, in jede Vertiefung geben und 30 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
- Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
- Waschschritt 5.8 wiederholen.
- PBS durch Aspiration entfernen, dann 2 ml warmes DMEM, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin, in jede Vertiefung geben und 60 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
- Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
- Waschschritt 5.8 wiederholen.
- Entfernen Sie PBS durch Aspiration und lysieren Sie HT-29-Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% Triton X-100 in jede Vertiefung geben.
- Inkubieren Sie 6-Well-Platten bei 37 °C für 5 Minuten.
- Verwenden Sie einen Zellschaber oder eine gebogene Pipettenspitze, um die lysierten Zellen vom Boden der Vertiefung abzukratzen und die vollen 1 ml in ein frisches 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
- Bestimmen Sie die Anzahl der intrazellulären Bakterien.
- Wirbeln Sie jedes Röhrchen (ab Schritt 5.15) mindestens 30 s lang, um Shigella weiter von den lysierten eukaryotischen Zellen zu verdrängen.
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von Lysaten in PBS vor.
- 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-2 und 1 x 10-3 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-2 und 1 x 10-3 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-3 bzw. 1 x 10-4.
6. Intrazellulärer Replikationsassay
HINWEIS: Alle Volumina stimmen mit einem Assay mit zwei 6-Well-Platten überein.
- Subkultur über Nacht Shigella-Kulturen durch 1:50-Verdünnung in frische Medien.
- Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
Anmerkungen: Begrenzen Sie das Kulturvolumen auf <20 % des Kulturkolben- oder Röhrchenvolumens, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu gewährleisten. - Bei 37 °C unter Schütteln bei 250 U/min inkubieren, bis die Zellen einen OD600 von 0,7 erreichen (Mid-Log-Phase des Shigella-Wachstums ); ca. 2-2,5 h.
HINWEIS: Während der Subkultur aliquotieren Sie 50 ml DMEM + 50 mg/ml Gentamicin und eine ausreichende Menge PBS für alle Waschschritte und legen Sie es in ein 37 °C heißes Wasserbad. Lassen Sie das Medium vor der Verwendung 37 °C erreichen.
- Vortexen und dann 100 μl jeder Übernachtkultur zu 5 ml frischem TSB oder TSB + BS in einem Kulturröhrchen geeigneter Größe hinzufügen.
- 2 x 108 KBE, subkultivierte Shigella in einzelne 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
HINWEIS: 2 x 108 KBE entsprechen ungefähr 1 ml Bakterienzellen bei einem OD600 von 0,7. Verwenden Sie OD600-Messwerte , um die KBE/ml entsprechend der Kalibrierung jedes einzelnen Spektralphotometers anzunähern. - Shigella-Proben 1x mit PBS waschen.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, fügen Sie dann 1 ml warmes PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, indem Sie die Probe vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Mischung vollständig homogen ist (8-10x).
- Wiederholen Sie Schritt 6.3.1. 1x zusätzliche Zeit.
- Pelletzellen durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, den Überstand absaugen und die Pellets in 2 ml warmem DMEM resuspendieren.
HINWEIS: Die Endkonzentration der resuspendierten Bakterien beträgt 1 x 108 KBE/ml.
- Vortex, dann 1 ml (1 x 108 KBE) resuspendierte Shigella plus 1 ml DMEM in jede Vertiefung der vorbereiteten HT-29-Dickdarmepithel-Monoschichten in 6-Well-Platten geben (aus Schritt 3.2.10.2).
HINWEIS: Infektionen werden normalerweise bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI; Verhältnis von Bakterien- zu Epithelzellen) von 100 durchgeführt. Um verschiedene MOIs zu testen, verdünnen Sie resuspendierte Shigellen in DMEM auf die gewünschte Konzentration und fügen Sie dann 1 ml verdünnte Bakterien zu HT-29-Monoschichten hinzu. Um beispielsweise einen MOI von 10 zu testen, verdünnen Sie Bakterien 1:10, indem Sie 150 μl 1 x 108 KBE/ml-Bakterien zu 1,35 ml DMEM hinzufügen und dann 1 ml (1 x 107 KBE) auf HT-29-Zellen auftragen. - Um den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen zu fördern, zentrifugieren Sie die 6-Well-Platten bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur oder 37 °C, wenn die Temperatureinstellung angepasst werden kann.
HINWEIS: Die Zentrifugation fördert den bakteriellen Kontakt mit den HT-29-Zellen, wodurch die Notwendigkeit von Adhärenzfaktoren umgangen wird und die Bakterien schnell in die Zellen eindringen können. - 6-Well-Platten bei 37 °C mit 5 % CO2 45 min inkubieren.
- Bestimmen Sie während der Inkubation den bakteriellen Infektionstiter.
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von resuspendierten Shigella-Zellen (aus Schritt 6.3.3) in PBS vor.
- 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 auf rote TSB + Kongo-Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-5 und 1 x 10-6 entspricht einem Endverdünnungsfaktor von 1 x 10-6 bzw. 1 x 10-7.
- Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
- Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
HINWEIS: Führen Sie beim Ansaugen von Medien aus 6-Well-Platten die Spitze des Aspirators entlang der Unterseite der Wells und versuchen Sie, den Kontakt mit den HT-29-Zellen zu vermeiden. - Geben Sie 1 ml warmes PBS in jede Vertiefung und waschen Sie es vorsichtig.
Anmerkungen: Um 6-Well-Monolayer sanft mit PBS zu waschen, bewegen Sie die Platte auf und ab und von Seite zu Seite auf der Tischplatte. Das Waschen von Platten in kreisenden Bewegungen und/oder das Entfernen der Platte von der Tischoberfläche kann dazu führen, dass Zellen mechanisch aus Kunststoff entfernt werden. - Wiederholen Sie die Schritte 6.8.1 und 6.8.2 2x weitere Male.
- Saugen Sie Medien aus jeder Vertiefung an.
- PBS durch Aspiration entfernen, dann 2 ml warmes DMEM, ergänzt mit 50 μg/ml Gentamicin, in jede Vertiefung geben und 30 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubieren.
- Waschen Sie infizierte HT-29-Zellen 3x gründlich mit 1 ml PBS.
- Waschschritt 6.8 wiederholen.
- Entfernen Sie PBS durch Aspiration, geben Sie dann 2 ml warmes DMEM mit 50 μg/ml Gentamicin in jede Vertiefung der 6-Well-Platten und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 für die gewünschte Zeitspanne, um eine intrazelluläre Replikation (bis zu 24 Stunden) zu ermöglichen.
- Waschen Sie die Zellen 2x gründlich mit 1 ml PBS.
- Waschschritt 6.8 wiederholen.
- Entfernen Sie PBS durch Aspiration und lysieren Sie HT-29-Zellen, indem Sie 1 ml PBS + 1% Triton X-100 in jede Vertiefung geben.
- Inkubieren Sie 6-Well-Platten bei 37 °C für 5 Minuten.
- Verwenden Sie einen Zellschaber oder eine gebogene Pipettenspitze, um die lysierten Zellen vom Boden der Vertiefung abzukratzen und die vollen 1 ml in ein frisches 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
- Bestimmen Sie die Anzahl der intrazellulären Bakterien.
- Jedes Röhrchen (ab Schritt 6.15) mindestens 30 s lang wirbeln, um Shigella weiter aus den lysierten eukaryotischen Zellen zu verdrängen.
- Bereiten Sie 10-fache serielle Verdünnungen von Lysaten in PBS vor.
- 100 μl der Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 auf TSB + Congo Red Platten auffüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Beschichtung von 100 μl aus den Verdünnungen 1 x 10-2, 1 x 10-3 und 1 x 10-4 entspricht einem endgültigen Verdünnungsfaktor von 1 x 10-3, 1 x 10-4 bzw. 1 x 10-5.
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Representative Results
Adhärenz-, Invasions- und intrazelluläre Replikationsassays wurden durchgeführt, um den Wildtyp (WT) von S. flexneri 2457T mit S. flexneri ΔVF (ΔVF) zu vergleichen, einer Mutante, von der angenommen wird, dass sie die Virulenz von Shigella negativ reguliert. Da Shigella Gallensalze als Signal zur Regulierung der Virulenz verwendet 17,18,47, wurden Experimente nach bakterieller Subkultur in TSB-Medien sowie TSB durchgeführt, das mit 0,4% (w/v) Gallensalzen ergänzt wurde 18. Die Exposition gegenüber Gallensalzen während des Subkulturschritts dient als Vorbehandlung, um die Dünndarmpassage vor einer Dickdarminfektion zu replizieren 17,18,47. Abbildung 1 analysiert die Wirkung der ΔVF-Mutation auf die Fähigkeit von S. flexneri, an HT-29-Dickdarmepithelzellen zu haften. Die prozentuale Adhärenz wird auf der y-Achse aufgetragen und stellt das Verhältnis der zurückgewonnenen Bakterien nach der HT-29-Lyse dar, standardisiert auf die Anzahl der Eingangsbakterien. Wie erwartet zeigten sowohl S. flexneri WT- als auch ΔVF-Stämme eine signifikante Zunahme der Adhärenz, wenn sie mit Gallensalz-Supplementierung subkultiviert wurden, im Vergleich zu TSB ohne Gallensalz-Supplementierung18. Es gab jedoch keinen Unterschied in der Adhärenz an HT-29-Zellen zwischen WT- und ΔVF-Mutantenstämmen innerhalb jeder Subkulturbedingung. Diese Daten deuten darauf hin, dass die ΔVF-Mutation keinen Einfluss auf die Fähigkeit von S. flexneri hat, mit oder ohne Gallensalzvorbehandlung an HT-29-Epithelzellen zu haften.
In Abbildung 2 wurde die Wirkung der ΔVF-Mutation auf die Fähigkeit von S. flexneri analysiert, in HT-29-Dickdarmepithelzellen mit oder ohne Gallensalzvorbehandlung einzudringen (Abbildung 2A) und sich zu replizieren (Abbildung 2B). Die prozentuale Wiederfindung ist auf der y-Achse dargestellt und stellt das Verhältnis der zurückgewonnenen Bakterienzellen nach HT-29-Zelllyse dar, standardisiert auf die Anzahl der Eingangsbakterien. In Abbildung 2A wurde ein signifikanter Anstieg der Fähigkeit von WT S. flexneri 2457T erwartet, nach Vorexposition mit Gallensalzen in HT-29-Zellen einzudringen48, während die S. flexneri ΔVF-Mutante im Vergleich zum WT-Stamm einen geringeren Anstieg der Invasion nach Gallensalzen vor der Exposition aufwies. Die ΔVF-Mutante hatte erhöhte Invasionsraten von HT-29-Zellen im Vergleich zu den WT, die in TSB subkultiviert wurden, hatte aber ähnliche Invasionsraten wie WT, wenn sie in TSB subkultiviert wurde, die mit Gallensalzen ergänzt wurde (Abbildung 2A). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ΔVF-Mutation die Fähigkeit von S. flexneri erhöht, in HT-29-Zellen einzudringen, was die Wirkung der Gallensalze vor der Exposition verringert, obwohl die Invasionsfähigkeit der ΔVF-Mutante nach der Gallensalz-Subkultur weiter zunahm.
Insgesamt wurden nach der Inkubation über Nacht 10-mal mehr Bakterien gefunden (Abbildung 2B) als nach der 90-minütigen Inkubation (Abbildung 2A), was die Unterschiede bei der Überwachung des intrazellulären Wachstums bzw. der Invasion zeigt. Wenn infizierte HT-29-Zellen 18 Stunden lang inkubiert wurden, um eine intrazelluläre Replikation der Bakterien zu ermöglichen (Abbildung 2B), verringerte sich die Wirkung der Gallensalz-Vorbehandlung sowohl für die WT- als auch für die ΔVF-Stämme . Die reduzierte Wirkung der Gallensalz-Vorbehandlung während der intrazellulären Replikation war jedoch für die ΔVF-Mutante dramatischer. Da der Anstieg der intrazellulären Replikation beider Stämme bei Vorexposition gegenüber Gallensalzen geringer war als der Anstieg der Invasionsraten unter den gleichen Bedingungen, stellen wir die Hypothese auf, dass Gallensalze einen größeren Einfluss auf die frühen Schritte der Pathogenese von S. flexneri haben. Die ΔVF-Mutante zeigte eine prozentuale Erholung von der Replikation über Nacht in HT-29-Zellen im Vergleich zu WT (Abbildung 2B) nach beiden Subkulturbedingungen. Die prozentualen Wiederfindungen der ΔVF-Mutante waren jedoch unabhängig von den Gallensalzen vor der Exposition ähnlich. Diese Datentrends deuten darauf hin, dass sich die ΔVF-Mutante im Vergleich zu WT effizienter in HT-29-Zellen repliziert und dass Gallensalze vor der Exposition die Fähigkeit der ΔVF-Mutante , sich intrazellulär zu replizieren, nicht beeinflussen, wie es bei WT beobachtet wurde (Abbildung 2B). Da der Unterschied zwischen den mutierten und WT-Stämmen in der Präexpositionsbedingung der Gallensalze während des 90-minütigen Invasionsassays nicht beobachtet wurde, stellen wir die Hypothese auf, dass das vom deletierten VF-Gen kodierte Produkt auch die Replikation von S. flexneri in HT-29-Zellen regulieren kann. Zusammengenommen zeigen beide Analysen, dass die ΔVF-Mutante im Vergleich zu WT virulenter ist, was darauf hindeutet, dass das VF-Genprodukt ein negativer Regulator der Virulenz von S. flexneri ist.
Abbildung 1: Gallensalze induzierten vor der Exposition die Adhärenz von S. flexneri an HT-29-Zellen. S. flexneri 2457T WT- und ΔVF-Mutantenzellen wurden entweder in TSB oder TSB subkultiviert, die mit 0,4% (w/v) Gallensalzen (TSB+BS) Medien ergänzt wurden. Die Bakterien wurden dann bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 auf HT-29-Zellen aufgebracht und 3 Stunden lang inkubiert, um die Adhärenz zu untersuchen. Nach der Inkubation wurden infizierte HT-29-Zellen gewaschen und lysiert, und serielle Verdünnungen der zurückgewonnenen Bakterien wurden plattiert, um koloniebildende Einheiten pro ml (KBE/ml) zu zählen. Die Anzahl der adhärenten Bakterien wird relativ zu den Eingabebakterientitern aufgetragen, um die prozentuale Adhärenz zu ermitteln. Die Daten sind repräsentativ für ein biologisches Replikat mit drei technischen Replikaten (einzelnen Punkten). Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. Die statistische Signifikanz wurde durch einen Student's t-Test bestimmt (*p < 0,05; ***p < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gallensalze vor der Exposition erhöhten die Invasion von WT S. flexneri und die intrazelluläre Replikation. S. flexneri 2457T WT- und ΔVF-Mutantenzellen wurden entweder in TSB oder TSB subkultiviert, die mit Gallensalzmedien (TSB+BS) ergänzt wurden. Die Bakterien wurden dann bei einem MOI von 100 auf HT-29-Zellen aufgebracht, auf die Zellen zentrifugiert und 45 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und extrazelluläre Bakterien wurden durch Zugabe von Gentamicin zum DMEM lysiert, um ausschließlich intrazelluläre Bakterien zurückzugewinnen. Nach 90 min (A, bakterielle Invasion) oder 18 h (B, intrazelluläre Replikation) Inkubationen wurden infizierte HT-29-Zellen gewaschen und lysiert, und serielle Verdünnungen der zurückgewonnenen Bakterien wurden plattiert, um koloniebildende Einheiten pro ml (KBE/ml) zu zählen. Die Anzahl der intrazellulären Bakterien wird relativ zu den eingegebenen Bakterientitern aufgetragen, um die prozentuale Wiederfindung zu ermitteln. Die Daten sind repräsentativ für ein biologisches Replikat mit jeweils drei technischen Replikaten (einzelnen Punkten). Fehlerbalken zeigen SEM an. Die statistische Signifikanz wurde durch den t-Test eines Studenten bestimmt (*p < 0,05). Bitte beachten Sie die Unterschiede in den y-Achsenskalen zwischen den Panels (A) und (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von drei standardisierten Assays zur Untersuchung der Shigella-Adhärenz, Invasion und intrazellulären Replikation von Darmepithelzellen. Obwohl es sich bei diesen Methoden lediglich um modifizierte Versionen klassischer Gentamicin-Assays handelt, die zur Untersuchung der Invasion und intrazellulären Replikation verschiedener bakterieller Krankheitserreger in Wirtszellen verwendet werden 49,50,51, müssen bei der Untersuchung von Shigella besondere Überlegungen angestellt werden.
Shigellen sind fakultative Anaerobier, die bei 37 °C in reichhaltigem Medium mit Belüftung43 optimal wachsen. Bei der Durchführung dieser Assays zur Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Umweltsignale oder Metaboliten auf Shigella-Infektionen wird empfohlen, Shigella über Nacht in Rich Media zu züchten und dann vor der Infektion in definierte oder ergänzte Medien zu subkultivieren. Die maximale Virulenzgenexpression tritt während der logarithmischen Wachstumsphase auf 52,53. Daher sind die Subkultivierung von Shigella-Kulturen über Nacht und das Zulassen des Bakterienwachstums in die exponentielle Phase (OD600 ~ 0,7) notwendige Schritte, um die Virulenz von Shigella richtig zu beurteilen. Darüber hinaus ist die Virulenzgenexpression temperaturabhängig. Um die Spezifität für die Expression nur während der Wirtsinfektion zu gewährleisten, werden Virulenzgene bei wirtsphysiologischen Temperaturen (37 °C) induziert und bei niedrigeren Temperaturen (z. B. 30 °C) streng unterdrückt54. Um die Expression von Virulenzgenen zu gewährleisten, müssen bakterielle Subkulturen und Infektionen bei 37 °C durchgeführt werden, wobei darauf zu achten ist, dass die Temperatur nicht unter 37 °C fällt. Ein großes Virulenzplasmid mit 220 Kilobasen, das die molekulare Maschinerie kodiert, die für die Invasion und Epithelzellinfektion erforderlich ist, ist eine wesentliche Virulenzdeterminante für alle Shigella spp.5. Wiederholtes Passieren und längeres Wachstum bei 37 °C fördern die Instabilität des Virulenzplasmids, was zu einem Plasmidverlust führt und Shigella-Zellen avirulentmacht 55. Um die Aufrechterhaltung des Virulenzplasmids und die Expression wichtiger Virulenzgene zu gewährleisten, wird empfohlen, Bakterien alle zwei Wochen direkt aus dem Gefrierschrank auf frische TSB + Kongo-rote Indikatorplatten zu restaurieren. Kongo-Rot-Agar kann verwendet werden, um zwischen wildtyp-virulenten (roten, CR+) Kolonien und avirulenten (weißen, CR-) Kolonien zu unterscheiden, die das Virulenzplasmid45 verloren haben. Wenn wiederholt eine Instabilität des Virulenzplasmids beobachtet wird, können Shigella-Kulturen über Nacht bei 30 °C inkubiert werden, um einen Verlust des Virulenzplasmids zu verhindern, gefolgt von einer Subkultivierung bei 37 °C, um die Virulenzgenexpression zu fördern43. Wenn schließlich Analysen mit Mutanten und/oder komplementären Stämmen durchgeführt werden, in denen Antibiotikamarker in diesen Bakterienstämmen vorhanden sind, wird empfohlen, die geeignete Antibiotikaauswahl während der bakteriellen Übernacht- und Subkultivierungsschritte zu verwenden.
Die Verwendung von HT-29-Epithelmonoschichten hat viele Vorteile für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Shigella-Pathogenese in vitro. Da Shigella ein an den Menschen angepasster Erreger ist, spiegeln Kleintiermodelle die charakteristische Pathogenese der Shigellose, die beim Menschen beobachtet wurde, nicht genau wider36. Die Verwendung standardisierter Protokolle für die Infektion von humanen Zelllinien ermöglicht somit die quantitative Untersuchung einzelner Schritte der bakteriellen Pathogenese, um das molekulare Zusammenspiel zwischen diesem Erreger und seinem nativen Wirt zu charakterisieren. In der Vergangenheit wurden HeLa-Zellen hauptsächlich zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen in vitro verwendet 25,56,57. HeLa-Zellen sind jedoch eine immortalisierte Gebärmutterhalskrebs-Zelllinie, bei der es sich um nicht-native Wirtszellen für enterische bakterielle Krankheitserreger handelt. Daher haben sich In-vitro-Studien zur enterischen Pathogenese auf die Verwendung von Dickdarm-Adenokarzinom-Zelllinien (z. B. HT-29, Caco-2 und T84) verlagert, die die intestinale Epithelmorphologie getreuer rekapitulieren und auf Transwells als epitheliale Monoschichten mit differenzierten apikalen und basolateralen Oberflächen gezüchtet werden können 58,59,60. Obwohl jede Zelllinie ihre individuellen Stärken und Schwächen hat, werden HT-29-Zellen in den hier beschriebenen Assays aufgrund phänotypischer Ähnlichkeiten mit intestinalen Enterozyten und einer robusten Expression von Zelloberflächenrezeptoren und proinflammatorischen Zytokinen verwendet 58,59,61. Bei jedem dieser diskutierten Modelle handelt es sich jedoch um von Krebs abgeleitete Zelllinien mit abweichenden Stoffwechsel- und Wachstumsphänotypen, die den natürlichen physiologischen Zustand des Dickdarmepithels in vivo nicht genau darstellen 58. Jüngste Fortschritte in der menschlichen Gewebekulturtechnik haben die Kultivierung menschlicher Darmstammzellen, die aus Gewebebiopsien gewonnen wurden, zu Organoiden oder einzelnen zweidimensionalen Zellmonoschichten ermöglicht, die die verschiedenen Zelltypen im menschlichen Magen-Darm-Trakt (GI) rekapitulieren 62,63,64 . Darmorganoide können so unterschieden werden, dass sie Enterozyten, schleimproduzierende Becherzellen, M-Zellen und andere gewebespezifische Zelltypen umfassen. Jüngste Studien haben die Verwendung dieser Organoidmodelle zur Untersuchung enterischer Krankheitserreger validiert, einschließlich verschiedener Shigella spp., Salmonella enterica und Escherichia coli pathovars 62,63,64. Obwohl Organoide genauere Modelle des menschlichen GI-Epithels sind und sogar unter verschiedenen Nährstoffbedingungen kultiviert werden können, um die Weltbevölkerung zu repräsentieren65, erfordert ihre relative Komplexität eine erhebliche Ausbildung und technisches Fachwissen, was im Vergleich zu herkömmlichen Krebszelllinien zu höheren Kosten und längeren Kultivierungszeiten führt58.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden mit mittlerem Durchsatz, bei denen zwei 6-Well-Platten für insgesamt 12 Monolayer verwendet werden, die für die Prüfung zur Verfügung stehen. Experimente können jedoch leicht skaliert werden, um die Anzahl der Monoschichten zu erhöhen, die ausgesät werden, um zusätzliche technische Replikate unterzubringen, oder um zusätzliche Shigella-Mutanten und Umweltsignale zu testen. Gewebekulturplatten mit mehr Wells (z. B. 12-Well- oder 24-Well-Platten) können auch mit entsprechenden Anpassungen verwendet werden, um Wells mit kleineren Durchmessern zu berücksichtigen. Unter den in Schritt 3.2 beschriebenen HT-29-Wachstumsbedingungen reichen die HT-29-Titer aus, um nach der Kultivierung aus einem T75-Kolben etwa sechs 6-Well-Platten zu säen, wobei genügend Zellen verbleiben, um die HT-29-Zellkultur aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sind die Aussaat von HT-29-Monoschichten und die Vorbereitung der inokulierenden Bakterienschritte zwischen bakteriellen Adhärenz-, Invasions- und intrazellulären Replikationsassays identisch. So können Assays, die dieselben Shigella-Stämme oder Subkulturbedingungen testen, problemlos parallel durchgeführt werden, um gleichzeitig die Rolle jeder experimentellen Bedingung in verschiedenen Schritten der Shigella-Infektion zu untersuchen.
Die Erholungstiter für adhärente (Schritt 4), eingedrungene (Schritt 5) und intrazelluläre Bakterien (Schritt 6) werden durch Ausplattierung serieller Verdünnungen infizierter HT-29-Zellen nach der Lyse bestimmt, was eine quantitative Bewertung der Effizienz jedes Stadiums der Shigella-Infektion ermöglicht. Die Zentrifugationsschritte in den Invasions- und intrazellulären Replikationsassays, die auf klassischen Assays 49,50,51 basieren, fördern den bakteriellen Kontakt mit den Wirtszellen für eine sofortige Invasion und erhöhen die Invasionsraten. Somit "überspringt" die Zentrifugation den Adhärenzschritt, der sich später als wichtiger Aspekt der Shigella-Infektion herausstellte 17,18,19,66. Es ist wichtig zu beachten, dass der Zentrifugenschritt nicht mit polarisierten Epithelzellen durchgeführt werden kann, die auf Transwells ausgesät wurden. Für den Adhärenz-Assay wird die Adhärenz jedoch nicht durch Zentrifugation erzwungen, und den infizierten HT-29-Zellen wird vor der Lyse kein Gentamicin zugesetzt, was die Zählung adhärenter Bakterienzellen ermöglicht. Das Volumen des Gewebekulturmediums wird auf 1 ml reduziert (im Gegensatz zu 2 ml für die Invasions- und intrazellulären Replikationsassays), um einen effizienteren Kontakt der Bakterien mit den HT-29-Zellen zu ermöglichen. Darüber hinaus kann es je nach Adhärenzrate während der 3-stündigen Inkubation zu einer gewissen Invasion und intrazellulären Replikation kommen, aber die Menge ist typischerweise vernachlässigbar (z. B. nur 0,05 % der wiedergewonnenen Bakterienpopulation nach der Wirtszelllyse). Um jedoch adhärente und intrazelluläre Bakterien während der 3-stündigen Inkubation richtig zu berücksichtigen, wird empfohlen, parallele Assays durchzuführen, bei denen zusätzlich zum angegebenen Protokoll eine zweite Platte mit 50 μg/ml Gentamicin in 2 ml DMEM pro Vertiefung für insgesamt 45 Minuten inkubiert wird (15 Minuten Inkubation, Waschen, frisches DMEM + Gentamycin für 30 Minuten), um extrazelluläre Bakterien gründlich zu lysieren. Nach der HT-29-Zelllyse, wie im Protokoll angegeben, können die intrazellulären Bakterien wie oben erwähnt gezählt werden und stellen die Anzahl der Bakterien dar, die eingedrungen sind. Dieser Wert kann dann ohne Gentamicin-Behandlung von den von der Platte gezählten Bakterien abgezogen werden, um anhaftende und eingedrungene Bakterien angemessen zu bestimmen. Parallele Analysen können auch durchgeführt werden, um einen besseren Einblick in die intrazelluläre Replikation von Shigella in HT-29-Zellen nach der Invasion zu erhalten, z. B. unter Verwendung mehrerer Zeitpunkte zur Durchführung intrazellulärer Wachstumskurven. Schließlich können neben der Zählung intrazellulärer Bakterien nach einer 18-stündigen Gentamicin-Inkubation die Kulturüberstände gesammelt und auf die Zytokinsekretion infizierter HT-29-Zellen analysiert werden. Zum Beispiel ist IL-8 ein Chemokin, das von Epithelzellen sezerniert wird und weitgehend dazu dient, PMNs an den Ort der Infektion zu rekrutieren. Die Menge an IL-8, die in die Kulturmedien infizierter HT-29-Zellen sezerniert wird, kann mit einem IL-8-ELISA-Assay67 analysiert werden.
Gallensalze haben sich als wichtiges Virulenzsignal für Shigellen während des Transports durch das menschliche GI-System erwiesen und können verwendet werden, um bakterielle Wachstumsmedien in diesen Protokollen zu ergänzen, um typische GI-Bedingungen zu replizieren. Natürlich werden Gallensalze in den Zwölffingerdarm oder den oberen Teil des Dünndarms eingeführt, um die Verdauung zu unterstützen. und im terminalen Ileum oder Ende des Dünndarms werden 95 % der Gallensalze entfernt und wieder in den Kreislauf zurückgeführt, um sich schließlich in der Gallenblaseabzulagern 68. Gallensalze haben normalerweise eine Konzentration zwischen 0,2 % und 2,0 % (w/v) im Dünndarm und sind von Natur aus bakterizid. Shigella widersteht jedoch zusammen mit den meisten Darmbakterien Gallensalzen und nutzt die Signale, um die Infektion zu verstärken47. Mehrere Studien haben dokumentiert, wie die Exposition gegenüber Gallensalzen, manchmal in Verbindung mit anderen Dünndarmsignalen wie Glukose, das Überleben von Shigellen und die Virulenzregulation vor der Infektion beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass Shigella gegen Gallensalze resistent ist, die Genexpression verändert und einen Biofilm unter Bedingungen bildet und verteilt, die die Dünndarmpassage reproduzieren17,69. Die Studien haben gezeigt, dass diese Veränderungen zu einem hypervirulenten Phänotyp führen, bei dem Adhärenz und Invasion bei einer nachfolgenden Dickdarminfektion durch Shigella induziert werden 17,18,19,48,66. Daher dokumentieren die oben beschriebenen Bedingungen, wie Shigellen in Gallensalzen subkultiviert werden, um die Dünndarmpassage vor der Durchführung der Adhärenz-, Invasions- oder intrazellulären Replikationsassays nachzuahmen. Die angegebene TSB-Formulierung enthält zugesetzte Glukose im Vergleich zu typischer Luria-Bouillon (LB)17. Wenn LB verwendet wird, ist es daher wichtig, die Medien auch mit Glukose (0,5%-2,0% [w/v]) zu ergänzen, um die Glukosesignale im Dünndarm angemessen zu berücksichtigen17. Darüber hinaus werden, wie oben erwähnt, alle Shigella-Subkulturen gewaschen, um Gallensalze zu entfernen und den Übergang zum Dickdarm für Infektionsanalysen nachzuahmen.
Traditionell und wie in den obigen Ergebnissen (Abbildung 1 und Abbildung 2) hervorgehoben, sind Infektionstests wertvoll, um die Rolle eines bestimmten Gens bei der Shigella-Infektion zu bestimmen. Der Phänotyp verschiedener Mutanten kann jedoch ohne eine angemessene Ergänzung der bakteriellen Nährmedien nicht wirklich gewürdigt werden. Wie frühere Forschungen gezeigt haben, verändern Gallensalze die Genexpression von S. flexneri signifikant, einschließlich Genen für den zentralen Stoffwechsel, Transkriptionsfaktoren, Zuckertransportern, Arzneimittelresistenz und Virulenzgenen, die entweder auf dem Chromosom oder dem Virulenzplasmid17 kodiert sind. Diese Gene geben Aufschluss darüber, wie Shigella Gallensalze als Signal verwendet, um die Genexpression zu verändern und sich auf eine eventuelle Infektion des Dickdarms vorzubereiten, und nachfolgende Mutationsanalysen müssen daher in den entsprechenden ergänzten bakteriellen Wachstumsmedien durchgeführt werden, bevor die Auswirkungen auf die Virulenz in den Adhärenz-, Invasions- und intrazellulären Replikationsassays untersucht werden. Wie oben in Abbildung 1 und Abbildung 2 zu sehen ist, hatte die ΔVF-Mutation keinen Einfluss auf die Adhärenz, aber auf die Invasion und die intrazelluläre Replikation. Da die Mutation die Invasion und die intrazelluläre Replikation verstärkte, laufen derzeit Experimente, um festzustellen, wie das Genprodukt die Infektion reguliert. Die Mutantenanalysen dienen als Beispiel dafür, wie neue Erkenntnisse über die Shigella-Pathogenese untersucht werden können, insbesondere unter Bedingungen, die den menschlichen Magen-Darm-Trakt besser replizieren. Geeignete Komplementationsanalysen werden empfohlen, um die Phänotypen verschiedener Mutanten zu validieren.
In Kombination beschreiben diese Verfahren quantitative Experimente, die wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen der Shigella-Adhärenz , Invasion und Replikation in HT-29-Dickdarmepithelzellen liefern, indem sie die natürliche Umgebung des menschlichen Magen-Darm-Trakts während der Infektion am besten nachahmen. Zukünftige Studien können die Mutanten und experimentellen Bedingungen erweitern, um ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wie sich Shigella auf menschliche Wirte vorbereitet und diese effektiv infiziert. Trotz jahrzehntelanger Forschung gibt es noch so viel mehr über die Shigella-Infektion zu entdecken.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Unterstützung der Autoren umfasst die Abteilung für Pädiatrie des Massachusetts General Hospital, den Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF) Award 2022A009041, den National Institute of Allergy and Infectious Diseases Grant R21AI146405 und den National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Grant Nutrition Obesity Research Center at Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PES filter | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media |
| 14 mL culture tubes | Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap |
| 6-well tissue culture plates | Corning | 3516 | Plates are treated for optimal cell attachment |
| Bile salts | Sigma-Aldrich | B8756 | 1:1 ratio of cholate to deoxycholate |
| Congo red dye | Sigma-Aldrich | C6277 | A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity |
| Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | To be used with the Countess Automated Cell Counter |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | A a highly polar organic reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat-inactivated, sterile |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G3632 | Stock concentration is 50 mg/mL |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin |
| Paraffin film | Bemis | PM999 | Laboratory sealing film |
| Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1x concentration; pH 7.4 |
| Select agar | Invitrogen | 30391023 | A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media |
| T75 flasks | Corning | 430641U | Tissue culture flasks |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | A common non-ionic surfactant and emulsifier |
| Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Bacterial growth media |
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