Summary
本方案描述了使用体外上皮细胞系询问志贺氏菌粘附、侵袭和细胞内复制的感染测定。
Abstract
人类适应的肠道细菌病原体志贺氏菌每年引起数百万例感染,在儿科患者中产生长期生长效应,并且是全球腹泻死亡的主要原因。由于病原体通过胃肠道并感染结肠内壁的上皮细胞,感染会引起水样或血性腹泻。随着抗生素耐药性的惊人增加和目前缺乏批准的疫苗,标准化的研究方案对于研究这种可怕的病原体至关重要。在这里,提出了使用结肠上皮细胞中细菌粘附、侵袭和细胞内复制的体外分析来检查志贺氏菌分子发病机制的方法。在感染分析之前,志贺氏菌菌落的毒力表型通过在琼脂平板上摄取刚果红染料来验证。在细菌培养过程中,也可以考虑使用补充的实验室培养基来模拟体内条件。然后,在标准化方案中使用细菌细胞,以已建立的感染多重感染感染组织培养板中的结肠上皮细胞,并适应分析感染的每个阶段。对于依从性测定,志贺氏菌细胞与降低的培养基水平一起孵育,以促进细菌与上皮细胞的接触。对于侵袭和细胞内复制测定,庆大霉素应用于不同的时间间隔,以消除细胞外细菌并能够评估侵袭和/或细胞内复制速率的定量。所有感染方案都通过连续稀释受感染的上皮细胞裂解物并相对于感染滴度在刚果红琼脂平板上铺板细菌集落形成单位来枚举贴壁、侵袭和/或细胞内细菌。总之,这些方案能够对上皮细胞志贺氏菌感染的每个阶段进行独立的表征和比较,以成功研究这种病原体。
Introduction
由肠道细菌病原体引起的腹泻病是全球卫生的重大负担。2016 年,腹泻病导致全球 130 万人死亡,是 5 岁以下儿童的第四大死因 1,2。革兰氏阴性肠道细菌病原体志贺氏菌是志贺氏菌病的病原体,志贺氏菌病是全球腹泻死亡的主要原因3。志贺菌病每年在低收入和中等收入国家的儿童中造成严重的发病率和死亡率4,5,而高收入国家的感染与日托中心、食源性和水源性疫情有关6,7,8,9。无效的疫苗开发10和抗微生物药物耐药性(AMR)11,12的上升使大规模志贺氏菌疫情的管理变得复杂。美国疾病控制与预防中心最近的数据显示,2020 年美国近 46% 的志贺氏菌感染表现出耐药性13,14,而世界卫生组织已宣布志贺氏菌为 AMR 优先病原体,迫切需要新疗法15。
志贺氏菌感染在摄入受污染的食物或水后,或通过直接与人接触,很容易通过粪口途径传播。志贺氏菌已进化为一种有效的、适应人类的病原体,其感染剂量为 10-100 种细菌,足以引起疾病16。在小肠转运过程中,志贺氏菌暴露于环境信号,例如高温和胆汁17。检测这些信号可诱导转录变化以表达毒力因子,从而增强细菌感染人结肠的能力 17,18,19。志贺氏菌不会从顶端表面侵入结肠上皮,而是在被滤泡相关上皮细胞内特化的抗原呈递微折叠细胞(M 细胞)摄取后穿过上皮层20、21、22。转胞吞作用后,志贺氏菌细胞被驻留巨噬细胞吞噬。志贺氏菌迅速逃离吞噬体并触发巨噬细胞死亡,导致促炎细胞因子的释放 5,23,24。然后志贺氏菌从基底外侧侵入结肠上皮细胞,裂解巨细胞液泡,并在细胞质中建立复制生态位 5,25。促炎细胞因子,特别是白细胞介素-8 (IL-8),将多形核中性粒细胞白细胞 (PMN) 募集到感染部位,从而削弱上皮紧密连接,并使细菌浸润上皮内膜以加剧基底外侧感染5。PMN 破坏受感染的上皮内膜以控制感染,从而导致细菌性(血性)痢疾的特征性症状5。尽管侵袭和细胞内复制机制已被彻底表征,但新的研究正在证明志贺氏菌感染的重要新概念,包括胃肠道 (GI) 转运期间的毒力调节17、依从性19、通过屏障通透性改善基底外侧通路26 和营养不良儿童的无症状携带27。
志贺氏菌属引起腹泻病的能力仅限于人类和非人灵长类动物 (NHP)28。已经为斑马鱼29、小鼠30、豚鼠31、兔子21、32、33 和猪34、35 开发了志贺氏菌肠道感染模型。然而,这些模型系统都不能准确复制人类感染期间观察到的疾病特征36。尽管已经建立了志贺氏菌病的非人灵长类模型来研究志贺氏菌的发病机制,但这些模型系统的实施成本高昂,并且需要人为的高感染剂量,比人类的感染剂量高出9个数量级37,38,39,40,41,42。因此,志贺氏菌对人类宿主感染的显着适应需要使用人源性细胞培养物来重建生理相关模型,以准确询问志贺氏菌的发病机制。
在这里,描述了详细的程序,以测量 志贺氏菌 对 HT-29 结肠上皮细胞的粘附、侵袭和复制率。使用这些标准化方案,可以研究细菌毒力基因和环境信号影响 志贺氏菌 感染每一步的分子机制,以更好地了解动态宿主-病原体相互作用关系。
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Protocol
1.试剂和材料的制备
注意:所有体积均与使用两个 6 孔板的测定一致。
- TSB 培养基:将 0.5 L 去离子 (DI) 水加入 15 g 胰蛋白酶大豆肉汤(TSB,参见 材料表)培养基和高压灭菌器中。在室温下储存。
- 胆汁盐培养基(TSB + BS):要制备含有0.4%(w/v)胆汁盐的TSB,将0.06g胆盐(BS,参见 材料表)重悬于15mL高压灭菌的TSB中。使用0.22μmPES过滤器过滤灭菌。
注意:胆汁盐由胆酸钠和脱氧胆酸钠的 1:1 混合物组成。使用前立即准备新鲜培养基。 - DMEM + 10% (v/v) FBS:将 5 mL 胎牛血清 (FBS) 加入 45 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中。储存在4°C。
- DMEM + 庆大霉素:向 50 mL 试管中加入 50 mL DMEM 和 50 μL 50 mg/mL 庆大霉素(参见 材料表)。
注意:在每次实验之前,将新鲜等分试样在37°C水浴中加热。 - PBS + 1% (v/v) Triton X-100:将 150 μL Triton X-100 加入 15 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。
注意:在每次实验之前,将新鲜等分试样在37°C水浴中加热。 - TSB + 刚果红指示板:在 1 L 瓶中加入 15 g TSB、7.5 g 精选琼脂和 0.125 g 刚果红染料(见 材料表)。加入 0.5 L 去离子水并高压灭菌。将 10-20 mL 培养基倒入单独的无菌培养皿 (100 mm x 15 mm) 中并使其凝固。
注意:刚果红是致癌的,是一种生殖毒素。确保使用适当的个人防护设备处理刚果红。有关更多信息,请参阅产品安全数据表。
注意:大约 20 块板由 0.5 升刚果红色介质制成。板可以提前 2-3 天准备好,并在室温下倒置直至使用。为了长期储存,将倒置的板放在4°C的塑料套管中长达3个月。 - DMEM + 10% (v/v) FBS 和 5% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO):将 42.5 mL DMEM、5 mL FBS 和 2.5 mL DMSO 加入 50 mL 试管中。储存在4°C。
2.细菌的制备
注意:所有志贺氏菌实验室培养和储存方案均改编自Payne, S. M.43。
注意: 志贺氏菌 属是风险组 2 病原体44。在 BSL-2 环境中进行所有实验室工作,并采取额外的安全措施,以限制由于 志贺氏菌 属感染剂量低而导致的意外暴露。
- 志 贺氏菌 从冷冻库存中生长
- 使用无菌施药器将少量冷冻培养物从低温小瓶转移到TSB + Congo红琼脂平板中。
- 对接种环进行火焰灭菌并使其冷却。在平板的一个象限上来回划线接种物。点燃环,让它冷却,然后从第一象限划到板的第二象限。重复上述步骤,将接种物划入平板的第三和第四象限。
注意:或者,在每个象限之间使用新鲜的无菌施药器进行条纹接种。 - 将板倒置并在37°C下孵育过夜。
注意:需要在温度≥37°C下孵育,以表达观察刚果红阳性(CR+)表型45所必需的志贺氏菌毒力因子。无毒菌落将具有白色外观,不会具有侵入性。 - 用石蜡膜密封板,并在4°C下冷藏。
注意:细菌菌落将在琼脂平板上保持活力 1-2 周。
- 志贺氏菌在液体培养物中的过夜生长
- 将 3 mL TSB 培养基等分装到无菌的 14 mL 培养管中。
- 使用无菌施药器挑选一个分离良好的红色 (CR+) 菌落,并重悬于液体培养基中。
- 将培养物在37°C下孵育过夜(16-18小时),以每分钟250转(rpm)振荡。
3. HT-29真核细胞的制备
注意:所有体积均与使用两个 6 孔板的测定一致。HT-29 细胞系购自 American Type Culture Collection (ATCC)。HT-29 维护协议改编自 ATCC建议 46。所有培养基在使用前应在37°C的水浴中预热。所有HT-29维护方案都应在生物安全柜中执行。在培养基中混合/处理 HT-29 细胞时避免产生气泡,以避免 pH 值发生剧烈变化。
- 从冷冻原液中解冻HT-29细胞
- 在37°C水浴中解冻HT-29细胞小瓶。
注意: 确保盖子完全保持在水面上方以避免污染。解冻时间应少于 2 分钟。 - 培养物完全解冻后立即将小瓶从水中取出,并用70%乙醇去污。确保从这一点开始的所有步骤都使用无菌技术执行。
- 将小瓶的所有内容物加入含有 9 mL DMEM + 10% FBS 的 15 mL 离心管中。在室温下以125× g 离心5分钟。
- 将上清液倒入废物容器中,并将沉淀重悬于10mL温热的DMEM + 10%FBS中。将重悬细胞转移到含有 10 mL 温热 DMEM + 10% FBS(总体积为 20 mL)的 75 cm2 组织培养瓶 (T75) 中。
- 在37°C下用5%CO2 孵育细胞,直到细胞达到90%汇合度(约6-7天)。
注意:汇合度是通过视觉近似来估计的。
- 在37°C水浴中解冻HT-29细胞小瓶。
- 接种 HT-29 细胞
- 在 37 °C 水浴中预热 20 mL PBS 和 50 mL DMEM + 10% FBS,并将 3 mL 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA 预热至室温。
- 一旦HT-29细胞(从步骤3.1开始)达到90%的汇合度,将T75烧瓶中的HT-29细胞培养基倒入废物容器中。将 ~10 mL 温热的 PBS 倒入烧瓶中,轻轻旋转进行清洗。将PBS倒入废物容器中。再次用温热的PBS清洗并倒出。
- 加入 2-3 mL 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-EDTA,并在整个表面积上轻轻旋转。在37°C与5%CO2 孵育4分钟。
- 从培养箱中取出烧瓶,轻轻旋转胰蛋白酶-EDTA,目视确保所有细胞从表面分离。
- 立即加入 6 mL 温热 DMEM + 10% FBS 以灭活胰蛋白酶。上下移液以充分混合。
- 将所有内容物转移到 15 mL 离心管中,并在室温下以 500 x g 旋转 5 分钟。
- 将上清液轻轻倒入废容器中,并将沉淀重悬于6mL温热的DMEM + 10%FBS中。
- 重悬后,立即将 10 μL 悬浮的 HT-29 细胞从培养物中间转移到 0.2 mL PCR 管中。向PCR管中加入10μL台盼蓝染料并混合。
- 将 10 μL HT-29 细胞/台盼蓝混合物加入一次性 Countess 细胞计数器室载玻片中(参见 材料表)。枚举活细胞的数量并计算细胞活力。
注意:记录样品中的细胞数时,请读取“活”细胞计数下的数字,而不是总细胞计数。或者,可以使用血细胞计数器手动进行细胞计数。 - 将 HT-29 细胞重悬于新鲜的 T75 烧瓶或 6 孔板中。
- 对于 T75 烧瓶:
- 轻轻移液混合,然后根据以下公式将 2.5 x 106 个细胞转移到新鲜的 T75 烧瓶中:
- 加入温 DMEM + 10% FBS 培养基至终体积为 20 mL(终浓度为 1.25 x 105 个细胞/mL)。
- 通过轻轻来回摇晃,将细胞均匀地分散在烧瓶中。
- 在37°C与5%CO2 孵育,直到细胞达到80%汇合度。
注意:为了获得最佳生长,每 ~3 天更换一次 T75 烧瓶中的 DMEM + 10% FBS 培养基。将培养基倒入废容器中,并向烧瓶中加入 10 mL 温热的 PBS。轻轻旋转 PBS 并将其倒入废物容器中。然后向烧瓶中加入 20 mL 新鲜、温暖的 DMEM + 10% FBS,并返回 37 °C、5% CO2 培养箱。
- 轻轻移液混合,然后根据以下公式将 2.5 x 106 个细胞转移到新鲜的 T75 烧瓶中:
- 对于 6 孔板:
- 轻轻移液混合,然后根据以下公式将 5.85 x 106 个细胞转移到新鲜的 50 mL 锥形管中:
- 加入温 DMEM + 10% FBS 培养基至终体积为 26 mL(终浓度为 2.25 x 105 个细胞/mL)。
- 轻轻移液混合,然后将 2 mL(4.5 x 105 个细胞)分配到 6 孔板的单个孔中。
- 通过轻轻上下和左右摇晃 2-3 次,将细胞均匀地分散在孔中。
- 在37°C与5%CO2 一起孵育,直到细胞达到80%-95%汇合度(约3-4天)。
注意:侵袭和细胞内复制测定建议使用 85% 汇合度,而依从性测定建议汇合度为 90%-95%。孵育 48 小时后,细胞应达到 ~85% 汇合度,终浓度约为 1 x 106 个细胞/孔。可能需要调整接种的细胞数量和孵育时间。
- 轻轻移液混合,然后根据以下公式将 5.85 x 106 个细胞转移到新鲜的 50 mL 锥形管中:
- 对于 T75 烧瓶:
- 制作冷冻 HT-29 原料
- 将 1 mL DMEM + 10% FBS + 5% DMSO 培养基等分到单个低温样品瓶中。
- 将步骤 3.2.7 中的 1 x 106 HT-29 细胞添加到每个小瓶中。根据以下公式计算细胞的体积:
- 将HT-29电池长期储存在-130°C以下的液氮蒸气储存冰箱中。
4.依从性测定
注意:所有体积均与使用两个 6 孔板的测定一致。
- 通过1:50稀释到新鲜培养基中对志贺氏菌过夜培养。
- 涡旋,然后在适当大小的培养管中加入 100 μL 每个过夜培养物到 5 mL 新鲜 TSB 或 TSB + BS 中。
注意:将培养体积限制在培养瓶或试管体积的 <20%,以确保适当的曝气。 - 在37°C下以250rpm振荡孵育,直到细胞达到0.7的光密度(OD600)( 志贺氏菌 生长的中期对数阶段);约2-2.5小时。
注意:在传代培养期间,将50mL DMEM和足够体积的PBS等分用于所有洗涤步骤,并置于37°C水浴中。使用前让培养基达到37°C。
- 涡旋,然后在适当大小的培养管中加入 100 μL 每个过夜培养物到 5 mL 新鲜 TSB 或 TSB + BS 中。
- 将 2 x 108 个菌落形成单位 (CFU) 传代培养 的志贺氏菌 转移到单个 2 mL 微量离心管中。
注意:2 x 108 CFU 对应于 OD600 为 0.7 时约 1 mL 细菌细胞。使用 OD600 读数根据每个分光光度计的校准来近似 CFU/mL。 - 用PBS洗涤每个 志贺氏菌 样品2次。
- 通过在室温下以 17,000 x g 离心 2 分钟来沉淀细胞。吸出上清液,然后加入 1 mL 温热的 PBS 并重悬沉淀,轻轻上下移液,直到混合物完全均匀 (8-10x)。
- 重复步骤 4.3.1 1 次。
- 通过在室温下以 17,000 x g 离心 2 分钟来沉淀细胞,吸出上清液,并将沉淀重悬于 2 mL 温热的 DMEM 中。
注意:重悬细菌的最终浓度为 1 x 108 CFU/mL。
- 涡旋,然后向6孔板中制备的HT-29结肠上皮单层的每个孔中加入1mL(1×108CFU )重悬 志贺氏菌 (从步骤3.2.10.2开始)。
注意:感染通常在感染的多重性(MOI;细菌与上皮细胞的比率)为100时进行。为了测试不同的 MOI,在温 DMEM 中将重悬 志贺氏菌 稀释至所需浓度,然后将 1 mL 稀释的细菌加入 HT-29 单层。例如,要测试 MOI 为 10,将 150 μL 1 x 108 CFU/mL 细菌加入 1.35 mL 温 DMEM 中以 1:10 稀释细菌,然后将 1 mL(1 x 107 CFU)应用于 HT-29 细胞。 - 将6孔板在37°C与5%CO2 孵育3小时。
- 在孵育期间,确定细菌感染滴度。
- 将重悬 志贺氏菌 细胞(从步骤4.3.3开始)的10倍连续稀释液制备到PBS中。
- 将100μL的1×10-5 和1×10-6 稀释液培养到TSB + Congo红板上,并在37°C下孵育过夜。
注:从 1 x 10-5 和 1 x 10-6 稀释液中接种 100 μL 分别对应于 1 x 10-6 和 1 x 10-7 的最终稀释因子。
- 孵育后,用PBS洗涤单层4-5x。
- 从每个孔中抽吸培养基。
注意:从 6 孔板吸出培养基时,将吸气器的尖端沿着孔的底部引导,尽量避免与 HT-29 细胞接触。 - 向每个孔中加入 1 mL 温热的 PBS 并轻轻洗涤。
注意:要用 PBS 轻轻洗涤 6 孔单层,请在工作台上上下左右移动板。以圆周运动清洗板和/或从工作台表面取下板会导致从塑料上机械去除细胞。 - 重复步骤 4.7.1 和 4.7.2 4 次。
- 从每个孔中抽吸培养基。
- 通过抽吸除除 PBS,并通过向每个孔中加入 1 mL PBS + 1% Triton X-100 来裂解 HT-29 细胞。
- 将6孔板在37°C孵育5分钟。
- 使用细胞刮刀或弯曲的移液器吸头从孔底部刮取裂解的细胞,并将完整的 1 mL 转移到新鲜的 1.7 mL 微量离心管中。
- 确定细胞相关细菌的数量。
- 涡旋每个试管(从步骤4.10开始)至少30秒,以进一步从裂解的真核细胞中置换 志贺氏菌 。
- 将裂解物的10倍连续稀释液稀释到PBS中。
- 将 100 μL 的 1 x 10-2、1 x 10-3 和 1 x 10-4 稀释液培养到 TSB + Congo 红板上,并在 37 °C 下孵育过夜。
注:从 1 x 10-2、1 x 10-3 和 1 x 10-4 稀释液中接种 100 μL 分别对应于 1 x 10-3、1 x 10-4 和 1 x 10-5 的最终稀释因子。
5. 侵袭试验
注意:所有体积均与使用两个 6 孔板的测定一致。
- 通过1:50稀释到新鲜培养基中对志贺氏菌过夜培养。
- 涡旋,然后在适当大小的培养管中加入 100 μL 每个过夜培养物到 5 mL 新鲜 TSB 或 TSB + BS 中。
注意:将培养体积限制在培养瓶或试管体积的 <20%,以确保适当的曝气。 - 在37°C下孵育,以250rpm振荡,直到细胞达到0.7的OD600 ( 志贺氏菌 生长的中期对数期);约2-2.5小时。
注意:在传代培养期间,将50mL DMEM + 50mg / mL庆大霉素和足够体积的PBS等分用于所有洗涤步骤,并置于37°C水浴中。使用前让培养基达到37°C。
- 涡旋,然后在适当大小的培养管中加入 100 μL 每个过夜培养物到 5 mL 新鲜 TSB 或 TSB + BS 中。
- 将 2 x 108 CFU 传代培养 的志贺氏菌 转移到单独的 2 mL 微量离心管中。
注意:2 x 108 CFU 对应于 OD600 为 0.7 时约 1 mL 细菌细胞。使用 OD600 读数根据每个分光光度计的校准来近似 CFU/mL。 - 用PBS洗涤 志贺氏菌 样品1x。
- 通过在室温下以 17,000 x g 离心 2 分钟来沉淀细胞。吸出上清液,然后加入 1 mL 温热的 PBS 并重悬沉淀,轻轻上下移液,直到混合物完全均匀 (8-10x)。
- 重复步骤 5.3.1。1 倍额外时间。
- 通过在室温下以 17,000 x g 离心 2 分钟来沉淀细胞,吸出上清液,并将沉淀重悬于 2 mL 温热的 DMEM 中。
注意:重悬细菌的最终浓度为 1 x 108 CFU/mL。
- 涡旋,然后向 6 孔板中制备的 HT-29 结肠上皮单层的每个孔中加入 1 mL (1 x 108 CFU) 重悬 志贺氏菌 和 1 mL DMEM(从步骤 3.2.10.2 开始)。
注意:感染通常在感染的多重性(MOI;细菌与上皮细胞的比率)为100时进行。为了测试不同的MOI,在DMEM中将重悬 志贺氏菌 稀释至所需浓度,然后向HT-29单层中加入1mL稀释细菌。例如,要测试 MOI 为 10,将 150 μL 的 1 x 108 CFU/mL 细菌加入 1.35 mL DMEM 中,然后向 HT-29 细胞中加入 1 mL(1 x 107 CFU),以 1:10 的比例稀释细菌。 - 为了促进细菌与HT-29细胞的接触,在室温下以2,000× g 离心6孔板10分钟,如果温度设置可以调节,则为37°C。
注意:离心促进细菌与HT-29细胞的接触,从而绕过了对粘附因子的需求,并允许细菌快速侵入细胞。 - 在37°C下用5%CO2 孵育6孔板45分钟。
- 在孵育期间,确定细菌感染滴度。
- 将重悬 的志贺氏菌 细胞(从步骤5.3.3开始)的10倍连续稀释液制备到PBS中。
- 将100μL的1×10-5 和1×10-6 稀释液培养到TSB + Congo红板上,并在37°C下孵育过夜。
注:从 1 x 10-5 和 1 x 10-6 稀释液中接种 100 μL 分别对应于 1 x 10-6 和 1 x 10-7 的最终稀释因子。
- 用 1 mL PBS 彻底洗涤受感染的 HT-29 细胞 3 次。
- 从每个孔中抽吸培养基。
注意:从 6 孔板吸出培养基时,将吸气器的尖端沿着孔的底部引导,尽量避免与 HT-29 细胞接触。 - 向每个孔中加入 1 mL 温热的 PBS 并轻轻洗涤。
注意:要用 PBS 轻轻洗涤 6 孔单层,请在工作台上上下左右移动板。以圆周运动清洗板和/或从工作台表面取下板会导致从塑料上机械去除细胞。 - 重复步骤 5.8.1 和 5.8.2 2 次。
- 从每个孔中抽吸培养基。
- 通过抽吸除除PBS,然后向每个孔中加入2mL补充有50μg/ mL庆大霉素的温DMEM,并在37°C下用5%CO2孵育30分钟。
- 用 1 mL PBS 彻底洗涤受感染的 HT-29 细胞 3 次。
- 重复洗涤步骤5.8。
- 通过抽吸除除PBS,然后向每个孔中加入2mL补充有50μg/ mL庆大霉素的温DMEM,并在37°C下用5%CO2孵育60分钟。
- 用 1 mL PBS 彻底洗涤受感染的 HT-29 细胞 3 次。
- 重复洗涤步骤5.8。
- 通过抽吸除除 PBS,并通过向每个孔中加入 1 mL PBS + 1% Triton X-100 来裂解 HT-29 细胞。
- 将6孔板在37°C孵育5分钟。
- 使用细胞刮刀或弯曲的移液器吸头从孔底部刮取裂解的细胞,并将完整的 1 mL 转移到新鲜的 1.7 mL 微量离心管中。
- 确定细胞内细菌的数量。
- 涡旋每个试管(从步骤5.15开始)至少30秒,以进一步从裂解的真核细胞中置换 志贺氏菌 。
- 将裂解物的10倍连续稀释液稀释到PBS中。
- 将100μL的1×10-2 和1×10-3 稀释液培养到TSB + Congo红板上,并在37°C下孵育过夜。
注:从 1 x 10-2 和 1 x 10-3 稀释液中接种 100 μL 分别对应于 1 x 10-3 和 1 x 10-4 的最终稀释因子。
6. 细胞内复制试验
注意:所有体积均与使用两个 6 孔板的测定一致。
- 通过1:50稀释到新鲜培养基中对志贺氏菌过夜培养。
- 涡旋,然后在适当大小的培养管中加入 100 μL 每个过夜培养物到 5 mL 新鲜 TSB 或 TSB + BS 中。
注意:将培养体积限制在培养瓶或试管体积的 <20%,以确保适当的曝气。 - 在37°C下孵育,以250rpm振荡,直到细胞达到0.7的OD600 ( 志贺氏菌 生长的中期对数期);约2-2.5小时。
注意:在传代培养期间,将50mL DMEM + 50mg / mL庆大霉素和足够体积的PBS等分用于所有洗涤步骤,并置于37°C水浴中。使用前让培养基达到37°C。
- 涡旋,然后在适当大小的培养管中加入 100 μL 每个过夜培养物到 5 mL 新鲜 TSB 或 TSB + BS 中。
- 将 2 x 108 CFU 传代培养 的志贺氏菌 转移到单独的 2 mL 微量离心管中。
注意:2 x 108 CFU 对应于 OD600 为 0.7 时约 1 mL 细菌细胞。使用 OD600 读数根据每个分光光度计的校准来近似 CFU/mL。 - 用PBS洗涤 志贺氏菌 样品1x。
- 通过在室温下以 17,000 x g 离心 2 分钟来沉淀细胞。吸出上清液,然后加入 1 mL 温热的 PBS 并重悬沉淀,轻轻上下移液,直到混合物完全均匀 (8-10x)。
- 重复步骤 6.3.1。1 倍额外时间。
- 通过在室温下以 17,000 x g 离心 2 分钟来沉淀细胞,吸出上清液,并将沉淀重悬于 2 mL 温热的 DMEM 中。
注意:重悬细菌的最终浓度为 1 x 108 CFU/mL。
- 涡旋,然后向6孔板中制备的HT-29结肠上皮单层的每个孔中加入1mL(1×108 CFU)重悬 志贺氏菌 和1mL DMEM(从步骤3.2.10.2开始)。
注意:感染通常在感染的多重性(MOI;细菌与上皮细胞的比率)为100时进行。为了测试不同的MOI,在DMEM中将重悬 志贺氏菌 稀释至所需浓度,然后向HT-29单层中加入1mL稀释细菌。例如,要测试 MOI 为 10,将 150 μL 的 1 x 108 CFU/mL 细菌加入 1.35 mL DMEM 中,以 1:10 的比例稀释细菌,然后将 1 mL(1 x 107 CFU)应用于 HT-29 细胞。 - 为了促进细菌与HT-29细胞的接触,在室温下以2,000× g 离心6孔板10分钟,如果温度设置可以调节,则为37°C。
注意:离心促进细菌与HT-29细胞的接触,从而绕过了对粘附因子的需求,并允许细菌快速侵入细胞。 - 在37°C下用5%CO2 孵育6孔板45分钟。
- 在孵育期间,确定细菌感染滴度。
- 将重悬 的志贺氏菌 细胞(从步骤6.3.3开始)的10倍连续稀释液制备到PBS中。
- 将100μL的1×10-5 和1×10-6 稀释液培养到TSB + Congo红板上,并在37°C下孵育过夜。
注:从 1 x 10-5 和 1 x 10-6 稀释液中接种 100 μL 分别对应于 1 x 10-6 和 1 x 10-7 的最终稀释因子。
- 用 1 mL PBS 彻底洗涤受感染的 HT-29 细胞 3 次。
- 从每个孔中抽吸培养基。
注意:从 6 孔板吸出培养基时,将吸气器的尖端沿着孔的底部引导,尽量避免与 HT-29 细胞接触。 - 向每个孔中加入 1 mL 温热的 PBS 并轻轻洗涤。
注意:要用 PBS 轻轻洗涤 6 孔单层,请在工作台上上下左右移动板。以圆周运动清洗板和/或从工作台表面取下板会导致从塑料上机械去除细胞。 - 重复步骤 6.8.1 和 6.8.2 2 次。
- 从每个孔中抽吸培养基。
- 通过抽吸除除PBS,然后向每个孔中加入2mL补充有50μg/ mL庆大霉素的温DMEM,并在37°C下用5%CO2孵育30分钟。
- 用 1 mL PBS 彻底洗涤受感染的 HT-29 细胞 3 次。
- 重复洗涤步骤6.8。
- 通过抽吸除除PBS,然后向6孔板的每个孔中加入2mL带有50μg/ mL庆大霉素的温DMEM,并在37°C下用5%CO2 孵育所需的时间长度,以允许细胞内复制(最多24小时)。
- 用 1 mL PBS 彻底洗涤细胞 2 次。
- 重复洗涤步骤6.8。
- 通过抽吸除除 PBS,并通过向每个孔中加入 1 mL PBS + 1% Triton X-100 来裂解 HT-29 细胞。
- 将6孔板在37°C孵育5分钟。
- 使用细胞刮刀或弯曲的移液器吸头从孔底部刮取裂解的细胞,并将全部 1 mL 转移到新鲜的 1.7 mL 微量离心管中。
- 确定细胞内细菌的数量。
- 涡旋每个试管(从步骤6.15开始)至少30秒,以进一步从裂解的真核细胞中置换 志贺氏菌 。
- 将裂解物的10倍连续稀释液稀释到PBS中。
- 将 100 μL 的 1 x 10-2、1 x 10-3 和 1 x 10-4 稀释液培养到 TSB + Congo Red 板上,并在 37 °C 下孵育过夜。
注:从 1 x 10-2、1 x 10-3 和 1 x 10-4 稀释液中接种 100 μL 分别对应于 1 x 10-3、1 x 10-4 和 1 x 10-5 的最终稀释因子。
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Representative Results
将 S. flexneri 2457T 野生型 (WT) 与 S. flexneri ΔVF (ΔVF) 进行比较,后者是一种假设负调节志贺氏菌毒力的突变体。由于志贺氏菌使用胆盐作为调节毒力的信号17,18,47,因此在TSB培养基中的细菌传代培养以及补充有0.4%(w/v)胆盐的TSB中进行实验18。在传代培养步骤中暴露胆汁盐可作为预处理,以在结肠感染之前复制小肠转运17,18,47。图 1 分析了 ΔVF 突变对 S. flexneri 粘附在 HT-29 结肠上皮细胞上的能力的影响。粘附百分比绘制在 y 轴上,表示标准化 HT-29 裂解后回收的细菌与输入细菌数量的比率。正如预期的那样,与不补充胆盐的 TSB 相比,补充胆盐的 TSB 传代培养时,S. flexneri WT 和 ΔVF 菌株的依从性显着增加18。然而,在每种传代培养条件下,WT和ΔVF突变株对HT-29细胞的粘附性没有差异。这些数据表明,ΔVF 突变对 S. flexneri 粘附在 HT-29 上皮细胞上的能力没有影响,无论是否使用胆盐预处理。
在图 2 中,分析了 ΔVF 突变对 HT-29 结肠上皮细胞内侵袭(图 2A)和复制能力(图 2B)的影响,无论是否使用胆盐预处理。回收率绘制在 y 轴上,表示标准化 HT-29 细胞裂解后回收的细菌细胞与输入细菌数量的比率。在图 2A 中,与 WT 菌株相比,WT S. flexneri 2457T 在预暴露于胆盐48 后侵袭 HT-29 细胞的能力预期显着增加,而 S. flexneri ΔVF 突变体在暴露前胆盐后侵袭的增加幅度较小。与在 TSB 中传代培养的 WT 相比,ΔVF 突变体对 HT-29 细胞的侵袭率增加,但在补充有胆盐的 TSB 中传代培养时,其侵袭率与 WT 相似(图 2A)。这些结果表明,ΔVF突变增强了S. flexneri侵袭HT-29细胞的能力,从而减轻了暴露前胆盐的影响,尽管ΔVF突变体的侵袭能力在胆盐传代培养后进一步增加。
总体而言,与90分钟孵育(图2A)相比,过夜孵育后回收的细菌(图2B)多10倍,这分别证明了监测细胞内生长与侵袭的差异。当将感染的HT-29细胞孵育18小时以允许细菌在细胞内复制时(图2B),胆汁盐预处理对WT和ΔVF菌株的影响均降低。然而,对于ΔVF突变体来说,细胞内复制期间胆盐预处理的降低效果更为显著。由于当预先暴露于胆盐时,两种菌株的细胞内复制的增加小于相同条件下侵袭率的增加,因此我们假设胆盐对 S. flexneri 发病机制的早期步骤有更大的影响。在两种传代培养条件下,与WT相比,ΔVF突变体在HT-29细胞内过夜复制的回收率有所增加(图2B)。然而,无论暴露前胆盐如何,ΔVF突变体的回收率都是相似的。这些数据趋势表明,与 WT 相比,ΔVF 突变体在 HT-29 细胞内复制效率更高,并且胆汁盐暴露前不会影响 ΔVF 突变体在细胞内复制的能力,如 WT 所观察到的那样(图 2B)。由于在 90 分钟的侵袭测定期间未观察到胆汁盐暴露前条件下突变株和 WT 菌株之间的差异,因此我们假设由缺失的 VF 基因编码的产物也可能调节 HT-29 细胞内的 S. flexneri 复制。综合起来,两种分析表明,ΔVF突变体相对于WT的毒性更强,这表明VF基因产物是S. flexneri毒力的负调节因子。
图 1:暴露前胆盐诱导 S. flexneri 粘附在 HT-29 细胞上。 将 S. flexneri 2457T WT 和 ΔVF 突变细胞在补充有 0.4% (w/v) 胆盐 (TSB+BS) 培养基的 TSB 或 TSB 中传代培养。然后将细菌以 100 的感染多重性 (MOI) 施加到 HT-29 细胞上,并孵育 3 小时以检查依从性。孵育后,洗涤和裂解感染的HT-29细胞,并对回收的细菌进行连续稀释,以计数每mL的菌落形成单位(CFU/mL)。相对于起始细菌滴度绘制贴壁细菌的数量,以确定贴壁细菌的百分比。数据代表一个生物学重复和三个技术重复(单个点)。误差线表示平均值的标准误差 (SEM)。统计学显著性由学生的 t 检验确定 (*p < 0.05; ***p < 0.001)。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:暴露前胆盐增加了 WT S. flexneri 侵袭和细胞内复制。 将 S. flexneri 2457T WT 和 ΔVF 突变细胞在补充有胆盐 (TSB+BS) 培养基的 TSB 或 TSB 中传代培养。然后将细菌以100的MOI施加到HT-29细胞上,离心到细胞上,并在37°C下用5%CO2 孵育45分钟。用PBS洗涤细胞,并通过向DMEM中加入庆大霉素来裂解细胞外细菌,以专门回收细胞内细菌。孵育90分钟(A,细菌入侵)或18小时(B,细胞内复制)孵育后,洗涤和裂解感染的HT-29细胞,并连续稀释回收的细菌,以计数每mL的菌落形成单位(CFU/mL)。绘制细胞内细菌数量相对于输入细菌滴度的图,以确定回收率。数据代表一个生物学重复,每个重复有三个技术重复(单个点)。误差线表示 SEM。 统计学显着性由学生的 t 检验 (*p < 0.05) 确定。请注意面板 (A) 和 (B) 之间 y 轴刻度的差异。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该方案描述了一组三种标准化测定法,用于研究志贺氏菌的粘附,侵袭和肠上皮细胞的细胞内复制。尽管这些方法只是用于研究宿主细胞内各种细菌病原体的侵袭和细胞内复制的经典庆大霉素测定法的改进版本49,50,51,但在研究志贺氏菌时必须特别考虑。
志贺氏菌是兼性厌氧菌,在37°C的富培养基中,曝气43,生长最佳。当进行这些测定以询问不同环境信号或代谢物对志贺氏菌感染的影响时,建议在富培养基中培养志贺氏菌过夜,然后在感染前将志贺氏菌传代培养到定义或补充的培养基中至对数期。最大毒力基因表达发生在生长的对数阶段52,53。因此,传代培养过夜志贺氏菌培养物并允许细菌生长至指数期(OD600~0.7)是正确评估志贺氏菌毒力的必要步骤。此外,毒力基因表达与温度有关。为了确保仅在宿主感染期间表达的特异性,在宿主生理温度(37°C)下诱导毒力基因,并在较低温度(例如30°C)下严格抑制54。为确保毒力基因的表达,必须在37°C下进行细菌传代培养和感染,并适当注意确保温度不低于37°C。 编码侵袭和上皮细胞感染所需的分子机制的 220 k0 kBase 大毒力质粒是所有志贺氏菌属 5 的重要毒力决定簇。在37°C下反复传代和长时间生长会促进毒力质粒不稳定性,导致质粒丢失并使志贺氏菌细胞无毒55。为确保毒力质粒的维持和关键毒力基因的表达,建议每两周将细菌直接从冷冻库中重新条纹到新鲜的TSB + Congo红色指示板上。刚果红琼脂可用于区分野生型毒力型(红色,CR+)菌落和失去毒力质粒45的无毒型(白色,CR-)菌落。如果反复观察到毒力质粒不稳定性,可以在30°C下孵育志贺氏菌过夜以防止毒力质粒丢失,然后在37°C下传代培养以促进毒力基因表达43。最后,如果对突变体和/或互补菌株进行分析,其中这些细菌菌株中存在抗生素标记物,则建议在细菌过夜和传代培养步骤中使用适当的抗生素选择。
HT-29上皮单层的利用对于研究志贺氏菌体外发病机制的分子机制具有许多优点。由于志贺氏菌是一种适应人类的病原体,因此小动物模型不能准确反映在人类中观察到的志贺菌病的特征发病机制36。因此,使用标准化方案感染人源性细胞系可以定量询问细菌发病机制的各个步骤,以表征该病原体与其天然宿主之间的分子相互作用。从历史上看,HeLa细胞主要用于研究体外宿主-病原体相互作用25,56,57。然而,HeLa细胞是一种永生化的宫颈癌细胞系,是肠道细菌病原体的非天然宿主细胞。因此,肠道发病机制的体外研究已转向使用结肠腺癌细胞系(例如HT-29、Caco-2和T84),这些细胞系更忠实地概括了肠上皮形态,并且可以在转孔上作为具有分化顶端和基底外侧表面的上皮单层生长58,59,60.尽管每种细胞系都有其各自的优点和缺点,但由于与肠肠细胞的表型相似性以及细胞表面受体和促炎细胞因子的稳健表达,HT-29 细胞被用于此处描述的测定 58,59,61。然而,这些讨论的模型中的每一个都是具有异常代谢和生长表型的癌源性细胞系,这些表型不能准确代表体内结肠上皮细胞的自然生理状态 58。人体组织培养技术的最新进展使得从组织活检中获得的人肠道干细胞能够培养成类器官或单个二维细胞单层,这些单层细胞概括了人类胃肠道 (GI) 中存在的各种细胞类型 62,63,64.肠道类器官可以分化为包括肠细胞、产生粘液的杯状细胞、M 细胞和其他组织特异性细胞类型。最近的研究验证了使用这些类器官模型研究肠道病原体,包括各种志贺氏菌属、肠道沙门氏菌和大肠杆菌病原体 62,63,64。尽管类器官是人类胃肠道上皮细胞的更准确模型,甚至可以在不同的营养条件下培养以代表全球人口65,但它们的相对复杂性需要大量的培训和技术专长,导致与传统癌细胞系相比,成本更高,培养时间更长58。
该协议描述了中等通量方法,其中两个 6 孔板用于总共 12 个可用于测试的单层。然而,可以很容易地扩大实验规模以增加接种的单层细胞的数量,以适应额外的技术重复,或测试额外的 志贺氏菌 突变体和环境信号。具有更多孔的组织培养板(例如,12 孔或 24 孔板)也可以通过适当的调整来考虑直径较小的孔。在步骤3.2中概述的HT-29生长条件下,HT-29滴度足以在从一个T75烧瓶培养后接种约6个6孔板,并有足够的剩余细胞来维持HT-29细胞培养。此外,HT-29单层的接种和接种细菌步骤的制备在细菌粘附、侵袭和细胞内复制测定之间是相同的。因此,可以很容易地同时进行测试相同 志贺氏菌 菌株或传代培养条件的测定,以同时检查每个实验条件在 志贺氏菌 感染的各个步骤中的作用。
通过在裂解后对受感染的 HT-29 细胞进行连续稀释来确定贴壁菌(步骤 4)、侵袭菌(步骤 5)和细胞内细菌(步骤 6)的回收滴度,从而可以定量评估志贺氏菌感染每个阶段的效率。基于经典测定49,50,51的侵袭和细胞内复制测定中的离心步骤促进细菌与宿主细胞的接触以立即侵袭并提高侵袭率。因此,离心“跳过”了粘附步骤,后来发现这是志贺氏菌感染的一个重要方面17,18,19,66。必须注意的是,离心步骤不能用接种在转孔上的极化上皮细胞进行。然而,对于贴附测定,离心不强制贴附,并且在裂解前不向感染的 HT-29 细胞中添加庆大霉素,从而允许计数贴壁细菌细胞。将组织培养基的体积减少到 1 mL(而不是侵袭和细胞内复制测定的 2 mL),以使细菌与 HT-29 细胞更有效地接触。此外,根据粘附率,在3小时孵育期间可能发生一些侵袭和细胞内复制,但量通常可以忽略不计(例如,宿主细胞裂解后仅回收细菌群的0.05%)。然而,为了在3小时孵育期间正确考虑贴壁细菌与细胞内细菌,建议进行平行测定,其中,除了所述方案外,将第二块板与50μg/ mL庆大霉素在每孔2mL DMEM中孵育共45分钟(孵育15分钟,洗涤,新鲜DMEM +庆大霉素30分钟)以彻底裂解细胞外细菌。如协议所述,在HT-29细胞裂解之后,细胞内细菌可以如上所述枚举,并将代表入侵的细菌数量。然后,可以在没有庆大霉素处理的情况下从板中计数的细菌中减去该值,以适当地确定贴壁和侵入的细菌。还可以进行平行分析,以更深入地了解侵袭后志贺氏菌在HT-29细胞内的细胞内复制,例如,使用多个时间点进行细胞内生长曲线。最后,在庆大霉素孵育 18 小时后,除了计数细胞内细菌外,还可以收集培养上清液并分析感染 HT-29 细胞的细胞因子分泌。例如,IL-8 是一种由上皮细胞分泌的趋化因子,主要起着将 PMN 募集到感染部位的作用。分泌到感染HT-29细胞培养基中的IL-8量可以用IL-8 ELISA测定67进行分析。
胆盐已被证明是志贺氏菌在通过人类胃肠道系统转运过程中的重要毒力信号,可用于补充这些方案中的细菌生长培养基以复制典型的胃肠道疾病。自然地,胆汁盐被引入十二指肠或小肠的上部以帮助消化;在末端回肠或小肠末端,95%的胆盐被去除并回收回循环中,最终沉积在胆囊中68。胆盐在小肠中的浓度通常在0.2%-2.0%(w/v)之间,具有天然杀菌作用。然而,志贺氏菌与大多数肠道细菌一样,对胆汁盐产生抗性,并利用这些信号来增强感染47。几项研究记录了胆盐暴露(有时与其他小肠信号(如葡萄糖)一起)如何影响志贺氏菌的存活率和感染前的毒力调节。志贺氏菌已被证明可以抵抗胆盐,改变基因表达,并在繁殖小肠转运的条件下形成和分散生物膜17,69。研究表明,这些变化导致高毒力表型,其中志贺氏菌17、18、19、48、66 在随后的结肠感染时诱导粘附和侵袭。因此,上述条件记录了如何在进行粘附、侵袭或细胞内复制测定之前在胆盐中传代培养志贺氏菌以模拟小肠转运。指定的 TSB 配方含有相对于典型 Luria 肉汤 (LB)17 的添加葡萄糖。因此,如果使用LB,重要的是还用葡萄糖(0.5%-2.0% [w / v])补充培养基,以适当考虑小肠中的葡萄糖信号17。此外,如上所述,所有志贺氏菌传代培养物均经过洗涤以去除胆汁盐并模拟向结肠的过渡以进行感染分析。
传统上,如上文结果(图1和图2)所示,感染测定对于确定特定基因在志贺氏菌感染中的作用很有价值。然而,如果没有适当补充细菌培养基,可能无法真正了解各种突变体的表型。正如先前的研究表明,胆盐显着改变 S. flexneri 基因表达,包括编码在染色体或毒力质粒 17 上的中枢代谢基因、转录因子、糖转运蛋白、耐药性和毒力基因。这些基因提供了志贺氏菌如何使用胆盐作为信号来改变基因表达并为最终的结肠感染做准备的见解,因此在检查对粘附性、侵袭和细胞内复制测定中的毒力的影响之前,需要在适当的补充细菌生长培养基中进行后续突变分析。如上图1和图2所示,ΔVF突变不影响粘附性,但影响侵袭和细胞内复制。由于突变增强了侵袭和细胞内复制,目前正在进行实验以确定基因产物如何调节感染。突变体分析可以作为如何研究志贺氏菌发病机制新理解的一个例子,特别是在更好地复制人类胃肠道的条件下。建议进行适当的互补分析以验证各种突变体的表型。
结合这些程序,这些程序描述了定量实验,这些实验将通过最好地模拟感染期间人类胃肠道的自然环境,为 志贺氏菌 粘附、侵袭和复制 HT-29 结肠上皮细胞的分子机制提供重要的见解。未来的研究可以扩展突变体和实验条件,以更好地了解 志贺氏菌 如何准备和有效感染人类宿主。尽管进行了数十年的研究,但关于 志贺氏菌 感染仍有许多发现。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
对作者的支持包括马萨诸塞州总医院儿科、研究临时支持基金执行委员会 (ISF) 奖 2022A009041、美国国家过敏和传染病研究所资助 R21AI146405 以及美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所资助哈佛大学营养肥胖研究中心 (NORCH) 2P30DK040561-26。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm PES filter | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media |
14 mL culture tubes | Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap |
50 mL conical tubes | Corning | 430829 | 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap |
6-well tissue culture plates | Corning | 3516 | Plates are treated for optimal cell attachment |
Bile salts | Sigma-Aldrich | B8756 | 1:1 ratio of cholate to deoxycholate |
Congo red dye | Sigma-Aldrich | C6277 | A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity |
Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | To be used with the Countess Automated Cell Counter |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | A a highly polar organic reagent |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat-inactivated, sterile |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G3632 | Stock concentration is 50 mg/mL |
HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin |
Paraffin film | Bemis | PM999 | Laboratory sealing film |
Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1x concentration; pH 7.4 |
Select agar | Invitrogen | 30391023 | A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media |
T75 flasks | Corning | 430641U | Tissue culture flasks |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | A common non-ionic surfactant and emulsifier |
Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging |
Tryptic Soy Broth (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Bacterial growth media |
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