Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Epitheelcelinfectieanalyses met Shigella

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66426
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Het huidige protocol beschrijft infectietests om de therapietrouw, invasie en intracellulaire replicatie van Shigella te ondervragen met behulp van in vitro epitheelcellijnen.

Abstract

De aan de mens aangepaste darmbacteriële ziekteverwekker Shigella veroorzaakt miljoenen infecties per jaar, creëert langdurige groei-effecten bij pediatrische patiënten en is wereldwijd een belangrijke oorzaak van sterfgevallen door diarree. Infectie veroorzaakt waterige of bloederige diarree als gevolg van de ziekteverwekker die het maagdarmkanaal passeert en de epitheelcellen langs de dikke darm infecteert. Met een duizelingwekkende toename van antibioticaresistentie en het huidige gebrek aan goedgekeurde vaccins, zijn gestandaardiseerde onderzoeksprotocollen van cruciaal belang voor het bestuderen van deze formidabele ziekteverwekker. Hier worden methodologieën gepresenteerd om de moleculaire pathogenese van Shigella te onderzoeken met behulp van in vitro analyses van bacteriële adherentie, invasie en intracellulaire replicatie in epitheelcellen van de dikke darm. Voorafgaand aan infectieanalyses werd het virulentiefenotype van Shigella-kolonies geverifieerd door de opname van de Congorode kleurstof op agarplaten. Aangevuld laboratoriummedium kan ook worden overwogen tijdens het kweken van bacteriën om in vivo omstandigheden na te bootsen. Bacteriële cellen worden vervolgens gebruikt in een gestandaardiseerd protocol om darmepitheelcellen in weefselkweekplaten te infecteren bij een vastgestelde multipliciteit van infectie met aanpassingen om elk stadium van infectie te analyseren. Voor hechtingstesten worden Shigella-cellen geïncubeerd met verlaagde medianiveaus om bacterieel contact met epitheelcellen te bevorderen. Voor zowel invasie- als intracellulaire replicatietests wordt gentamicine gedurende verschillende tijdsintervallen toegepast om extracellulaire bacteriën te elimineren en de beoordeling van invasie en/of de kwantificering van intracellulaire replicatiesnelheden mogelijk te maken. Alle infectieprotocollen sommen aanhangende, binnengedrongen en/of intracellulaire bacteriën op door geïnfecteerde epitheelcellysaten serieel te verdunnen en bacteriële kolonievormende eenheden te plateren ten opzichte van infecterende titers op Congo-rode agarplaten. Samen maken deze protocollen onafhankelijke karakterisering en vergelijkingen mogelijk voor elk stadium van Shigella-infectie van epitheelcellen om deze ziekteverwekker met succes te bestuderen.

Introduction

Diarreeziekten veroorzaakt door darmbacteriële pathogenen vormen een aanzienlijke wereldwijde gezondheidslast. In 2016 waren diarreeziekten verantwoordelijk voor 1,3 miljoen sterfgevallen wereldwijd en waren ze de vierde belangrijkste doodsoorzaak bij kinderen jonger dan vijf jaar 1,2 jaar. De Gram-negatieve, enterische bacteriële ziekteverwekker Shigella is de veroorzaker van shigellose, een belangrijke oorzaak van sterfgevallen door diarreewereldwijd3. Shigellose veroorzaakt elk jaar aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij kinderen uit lage- en middeninkomenslanden 4,5, terwijl infecties in landen met een hoog inkomen verband houden met uitbraken van kinderdagverblijven, door voedsel overgedragen en door water overgedragen uitbraken 6,7,8,9. Ineffectieve vaccinontwikkeling10 en stijgende percentages antimicrobiële resistentie (AMR)11,12 hebben het beheer van grootschalige Shigella-uitbraken bemoeilijkt. Uit recente gegevens van de Centers for Disease Control and Prevention blijkt dat bijna 46% van de Shigella-infecties in de Verenigde Staten in 2020 resistentie tegen geneesmiddelen vertoonde13,14, terwijl de Wereldgezondheidsorganisatie Shigella heeft uitgeroepen tot een prioritaire AMR-ziekteverwekker waarvoor dringend nieuwe therapieën nodig zijn15.

Shigella-infecties worden gemakkelijk overgedragen via de fecaal-orale route bij inname van besmet voedsel of water, of door direct menselijk contact. Shigella is geëvolueerd tot een efficiënte, aan de mens aangepaste ziekteverwekker, met een infectieuze dosis van 10-100 bacteriën die voldoende zijn om ziekte te veroorzaken16. Tijdens de overgang van de dunne darm wordt Shigella blootgesteld aan omgevingssignalen, zoals verhoogde temperatuur en gal17. Detectie van deze signalen induceert transcriptionele veranderingen om virulentiefactoren tot expressie te brengen die het vermogen van de bacteriën om de menselijke dikke darm te infecteren verbeteren 17,18,19. Shigella dringt het epitheel van de dikke darm niet binnen vanaf het apicale oppervlak, maar passeert eerder door de epitheellaag na opname in gespecialiseerde antigeenpresenterende microvouwcellen (M-cellen) in het follikel-geassocieerde epitheel 20,21,22. Na transcytose worden Shigella-cellen gefagocyteerd door residente macrofagen. Shigella ontsnapt snel aan het fagosoom en veroorzaakt de celdood van macrofagen, wat resulteert in het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines 5,23,24. Shigella dringt vervolgens de epitheelcellen van de dikke darm binnen vanaf de basolaterale zijde, lyseert de macropinocytaire vacuole en vestigt een replicatieve niche in het cytoplasma 5,25. Pro-inflammatoire cytokines, met name interleukine-8 (IL-8), rekruteren polymorfonucleaire neutrofiele leukocyten (PMN's) naar de plaats van infectie, wat de epitheliale tight junctions verzwakt en bacteriële infiltratie van de epitheelbekleding mogelijk maakt om de basolateraleinfectie te verergeren. De PMN's vernietigen het geïnfecteerde epitheelslijmvlies om de infectie in te dammen, wat resulteert in de karakteristieke symptomen van bacillaire (bloederige)dysenterie. Hoewel invasie- en intracellulaire replicatiemechanismen grondig zijn gekarakteriseerd, toont nieuw onderzoek belangrijke nieuwe concepten aan bij Shigella-infectie, waaronder virulentieregulatie tijdens gastro-intestinale (GI) transit17, therapietrouw19, verbeterde basolaterale toegang door barrièrepermeabiliteit26 en asymptomatisch dragerschap bij ondervoede kinderen27.

Het vermogen van Shigella spp. om diarree te veroorzaken is beperkt tot mensen en niet-menselijke primaten (NHP)28. Shigella darminfectiemodellen zijn ontwikkeld voor zebravissen29, muizen30, cavia's31, konijnen 21,32,33 en varkens34,35. Geen van deze modelsystemen kan echter nauwkeurig de ziektekenmerken repliceren die worden waargenomen tijdens menselijke infectie36. Hoewel NHP-modellen van shigellose zijn opgesteld om de pathogenese van Shigella te bestuderen, zijn deze modelsystemen duur om te implementeren en vereisen ze kunstmatig hoge infectieuze doses, tot negen ordes van grootte hoger dan de infectieuze dosis van mensen 37,38,39,40,41,42. De opmerkelijke aanpassing van Shigella voor infectie van menselijke gastheren vereist dus het gebruik van van mensen afgeleide celculturen om fysiologisch relevante modellen na te bootsen voor nauwkeurige ondervraging van de pathogenese van Shigella.

Hier worden gedetailleerde procedures beschreven om de mate van Shigella-therapietrouw , invasie van en replicatie in HT-29 colonepitheelcellen te meten. Met behulp van deze gestandaardiseerde protocollen kunnen de moleculaire mechanismen waarmee bacteriële virulentiegenen en omgevingssignalen elke stap van Shigella-infectie beïnvloeden, worden ondervraagd om de dynamische interactierelatie tussen gastheer en ziekteverwekker beter te begrijpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van reagentia en materialen

OPMERKING: Alle volumes komen overeen met een test met behulp van twee platen met 6 putjes.

  1. TSB medium: Voeg 0,5 L gedeïoniseerd (DI) water toe aan 15 g Tryptic Soy Broth (TSB, zie Tabel met Materialen) medium en autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur.
  2. Galzouten medium (TSB + BS): Om TSB te bereiden die 0,4% (m/v) galzouten bevat, resuspendeert u 0,06 g galzouten (BS, zie materiaaltabel) in 15 ml geautoclaveerde TSB. Filter steriliseer met een PES-filter van 0,22 μm.
    OPMERKING: De galzouten bestaan uit een 1:1 mengsel van natriumcholaat en natriumdeoxycholaat. Bereid verse media direct voor gebruik voor.
  3. DMEM + 10% (v/v) FBS: Voeg 5 ml foetaal runderserum (FBS) toe aan 45 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Bewaren bij 4 °C.
  4. DMEM + gentamicine: Voeg aan een buisje van 50 ml 50 ml DMEM en 50 μl 50 mg/ml gentamicine toe (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Maak verse aliquot en verwarm voor elk experiment in een waterbad van 37 °C.
  5. PBS + 1% (v/v) Triton X-100: Voeg 150 μL Triton X-100 toe aan 15 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    OPMERKING: Maak verse aliquot en verwarm voor elk experiment in een waterbad van 37 °C.
  6. TSB + Congo rode indicatorplaatjes: Voeg 15 g TSB, 7,5 g geselecteerde agar en 0,125 g rode kleurstof Congo (zie materiaaltabel) toe aan een fles van 1 liter. Voeg 0,5 L DI-water en autoclaaf toe. Giet 10-20 ml media in afzonderlijke steriele petrischaaltjes (100 mm x 15 mm) en laat stollen.
    LET OP: Congorood is kankerverwekkend en een voortplantingstoxine. Zorg ervoor dat de behandeling van Congorood wordt uitgevoerd met behulp van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Raadpleeg het productveiligheidsinformatieblad voor meer informatie.
    OPMERKING: Ongeveer 20 platen zijn gemaakt van 0,5 L Congo red media. Borden kunnen 2-3 dagen van tevoren worden bereid en tot gebruik omgekeerd op kamertemperatuur worden bewaard. Voor langdurige opslag plaatst u omgekeerde platen maximaal 3 maanden in plastic hoezen bij 4 °C.
  7. DMEM + 10% (v/v) FBS en 5% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO): Voeg 42,5 ml DMEM, 5 ml FBS en 2,5 ml DMSO toe aan een buisje van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.

2. Bereiding van bacteriën

OPMERKING: Alle Shigella-laboratoriumteelt - en opslagprotocollen zijn aangepast van Payne, SM 43.

LET OP: Shigella spp. zijn ziekteverwekkers van risicogroep2 44. Voer alle laboratoriumwerkzaamheden uit in een BSL-2-omgeving, met aanvullende veiligheidsmaatregelen om accidentele blootstellingen als gevolg van de lage infectieuze dosis Shigella spp. te beperken.

  1. Groei van Shigella uit bevroren voorraden
    1. Breng een kleine hoeveelheid bevroren cultuur over van de cryogene injectieflacon naar een TSB + Congo rode agarplaat met behulp van een steriele applicator.
    2. Steriliseer een inoculatielus met een vlam en laat deze afkoelen. Streep het inoculum heen en weer over een kwadrant van de plaat. Vlam de lus, laat hem afkoelen en streep dan van het eerste kwadrant naar het tweede kwadrant van de plaat. Herhaal dit om het inoculum in het derde en vierde kwadranten van de plaat te strepen.
      OPMERKING: U kunt ook inoculum aanbrengen met een verse steriele applicator tussen elk kwadrant.
    3. Keer de plaat om en incubeer gedurende een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Incubatie bij temperaturen ≥37 °C is vereist voor de expressie van Shigella-virulentiefactoren die nodig zijn voor de waarneming van Congorood-positief (CR+) fenotype45. Avirulente kolonies hebben een wit uiterlijk en zijn niet invasief.
    4. Sluit de plaat af met paraffinefolie en bewaar gekoeld bij 4 °C.
      OPMERKING: Bacteriekolonies blijven 1-2 weken levensvatbaar op agarplaten.
  2. Nachtelijke groei van Shigella in vloeibare cultuur
    1. Aliquot 3 ml TSB-media in steriele kweekbuisjes van 14 ml.
    2. Kies een enkele, goed geïsoleerde rode (CR+) kolonie met behulp van een steriele applicator en resuspendeer in vloeibare media.
    3. Incubeer culturen 's nachts (16-18 uur) bij 37 °C met schudden bij 250 omwentelingen per minuut (rpm).

3. Bereiding van HT-29 eukaryote cellen

OPMERKING: Alle volumes komen overeen met een test met behulp van twee platen met 6 putjes. HT-29 cellijnen werden verworven uit de American Type Culture Collection (ATCC). HT-29 onderhoudsprotocollen zijn aangepast aan ATCC-aanbevelingen46. Alle media moeten voor gebruik worden voorverwarmd in een waterbad van 37 °C. Alle HT-29 onderhoudsprotocollen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. Produceer geen luchtbellen bij het mengen/werken met HT-29-cellen in media om dramatische veranderingen in pH te voorkomen.

  1. Ontdooien van HT-29-cellen uit bevroren voorraad
    1. Ontdooi de injectieflacon met HT-29-cellen in een waterbad van 37 °C.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de dop volledig boven het water blijft om besmetting te voorkomen. Het ontdooien duurt minder dan 2 minuten.
    2. Haal de injectieflacon onmiddellijk uit het water nadat de cultuur volledig is ontdooid en ontsmet met 70% ethanol. Zorg ervoor dat alle stappen vanaf dit punt worden uitgevoerd met behulp van aseptische technieken.
    3. Voeg de volledige inhoud van de injectieflacon toe aan een centrifugebuis van 15 ml met 9 ml DMEM + 10% FBS. Centrifugeer op 125 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Doe het supernatans in een afvalcontainer en resuspendeer de pellet in 10 ml warme DMEM + 10% FBS. Breng geresuspendeerde cellen over in een weefselkweekkolf van 75 cm2 (T75) met 10 ml warme DMEM + 10% FBS (totaal volume van 20 ml).
    5. Incubeer cellen bij 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen 90% confluentie bereiken (ongeveer 6-7 dagen).
      OPMERKING: Confluency wordt geschat door middel van visuele benadering.
  2. HT-29 cellen zaaien
    1. Verwarm 20 ml PBS en 50 ml DMEM + 10% FBS voor in een waterbad van 37 °C en verwarm 3 ml 0,25% (m/v) trypsine-EDTA voor tot kamertemperatuur.
    2. Zodra HT-29-cellen (uit stap 3.1) 90% confluentie hebben bereikt, decanteert u HT-29-celkweekmedia uit de T75-kolf in een afvalcontainer. Giet ~10 ml warme PBS in de kolf en draai voorzichtig om te wassen. Doe de PBS in een afvalcontainer. Was opnieuw met warme PBS en decanteer.
    3. Voeg 2-3 ml 0,25% (g/v) trypsine-EDTA toe en draai voorzichtig over het hele oppervlak. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 4 min.
    4. Haal de kolf uit de incubator en draai de trypsine-EDTA voorzichtig rond, waarbij u er visueel voor zorgt dat alle cellen loskomen van het oppervlak.
    5. Voeg onmiddellijk 6 ml warme DMEM + 10% FBS toe om de trypsine te deactiveren. Pipeteer op en neer om goed te mengen.
    6. Breng de volledige inhoud over in een centrifugebuis van 15 ml en draai deze gedurende 5 minuten op 500 x g bij kamertemperatuur.
    7. Decanteer het supernatant voorzichtig in een afvalcontainer en resuspendeer de pellet in 6 ml warme DMEM + 10% FBS.
    8. Breng onmiddellijk na de resuspensie 10 μL gesuspendeerde HT-29-cellen over vanuit het midden van de kweek naar een PCR-buis van 0,2 ml. Voeg 10 μL Trypan blauwe kleurstof toe aan de PCR-buis en meng.
    9. Voeg 10 μL HT-29 cel/Trypan blauw mengsel toe aan een wegwerp Countess cell teller kamerglaasje (zie Tabel met materialen). Tel het aantal levende cellen op en bereken de levensvatbaarheid van de cellen.
      OPMERKING: Wanneer u het aantal cellen in het monster documenteert, leest u het aantal onder het aantal "levende" cellen, niet het totale aantal cellen. Als alternatief kan celtelling handmatig worden uitgevoerd met behulp van een hemocytometer.
    10. Zaad geresuspendeerde HT-29-cellen in een verse T75-kolf of plaat met 6 putjes.
      1. Voor de T75-kolf:
        1. Pipetteer voorzichtig om te mengen en breng vervolgens 2,5 x 106 cellen over in een verse T75-kolf volgens de onderstaande vergelijking:
          Equation 1
        2. Voeg warme DMEM + 10% FBS-media toe tot een eindvolume van 20 ml (eindconcentratie van 1,25 x 105 cellen/ml).
        3. Verdeel de cellen gelijkmatig over de kolf door zachtjes heen en weer te wiegen.
        4. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen 80% confluentie bereiken.
          OPMERKING: Vervang voor een optimale groei de DMEM + 10% FBS-media in de T75-kolf elke ~3 dagen. Decanteer media in een afvalcontainer en voeg 10 ml warme PBS toe aan de kolf. Draai de PBS voorzichtig rond en giet het in de afvalcontainer. Voeg vervolgens 20 ml verse, warme DMEM + 10% FBS toe aan de kolf en doe terug in de incubator van 37 °C, 5% CO2 .
      2. Voor plaat met 6 putjes:
        1. Pipetter voorzichtig om te mengen en breng vervolgens 5,85 x 106 cellen over in een verse conische buis van 50 ml volgens de onderstaande vergelijking:
          Equation 2
        2. Voeg warme DMEM + 10% FBS-media toe tot een eindvolume van 26 ml (eindconcentratie van 2,25 x 105 cellen/ml).
        3. Pipetter voorzichtig om te mengen en doseer vervolgens 2 ml (4,5 x 105 cellen) in afzonderlijke putjes met platen met 6 putjes.
        4. Verdeel de cellen gelijkmatig over de put door 2-3x zachtjes omhoog/omlaag en links/rechts te schommelen.
        5. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen 80%-95% confluentie bereiken (ongeveer 3-4 dagen).
          OPMERKING: 85% confluentie wordt aanbevolen voor invasie- en intracellulaire replicatietests, terwijl 90%-95% confluentie wordt aanbevolen voor therapietrouwtests. Cellen moeten ~85% confluentie bereiken na 48 uur incubatie met een uiteindelijke concentratie van ongeveer 1 x 106 cellen/put. Het kan nodig zijn het aantal ingezaaide cellen en de incubatietijd aan te passen.
  3. Diepgevroren HT-29 bouillons maken
    1. Aliquot 1 ml DMEM + 10% FBS + 5% DMSO-media in individuele cryogene injectieflacons.
    2. Voeg 1 x 106 HT-29 cellen uit stap 3.2.7 toe aan elke injectieflacon. Bereken het volume van cellen volgens de onderstaande formule:
      Equation 3
    3. Bewaar HT-29-cellen langdurig onder -130 °C in de vriezer voor opslag van vloeibare stikstofdamp.

4. Hechtingstest

OPMERKING: Alle volumes komen overeen met een test met behulp van twee platen met 6 putjes.

  1. Subcultuur van de ene op de andere dag Shigella-culturen via 1:50 verdunning in verse media.
    1. Vortex, voeg vervolgens 100 μL van elke nachtelijke cultuur toe aan 5 ml verse TSB of TSB + BS in een kweekbuis van de juiste grootte.
      NOTITIE: Beperk het kweekvolume tot <20% van het volume van de kweekkolf of buis om een goede beluchting te garanderen.
    2. Incubeer bij 37 °C met schudden bij 250 tpm totdat de cellen een optische dichtheid (OD600) van 0,7 hebben bereikt (mid-log-fase van Shigella-groei ); ongeveer 2-2,5 uur.
      OPMERKING: Tijdens de subcultuur, aliquot 50 ml DMEM en een voldoende hoeveelheid PBS voor alle wasstappen en in een waterbad van 37 °C plaatsen. Laat media voor gebruik 37 °C bereiken.
  2. Breng 2 x 108 kolonievormende eenheden (CFU's) gesubcultiveerde Shigella over naar individuele microcentrifugebuisjes van 2 ml.
    OPMERKING: 2 x 108 CFU's komt overeen met ongeveer 1 ml bacteriële cellen bij een OD600 van 0,7. Gebruik OD600-metingen om CFU/ml te benaderen volgens de kalibratie van elke afzonderlijke spectrofotometer.
  3. Was elk Shigella-monster 2x met PBS.
    1. Pelletcellen door centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant op, voeg dan 1 ml warme PBS toe en resuspendeer de pellet goed, pipetter het monster voorzichtig op en neer totdat het mengsel volledig homogeen is (8-10x).
    2. Herhaal stap 4.3.1 1x extra tijd.
    3. Pelletcellen centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, zuigen het supernatant op en resuspenderen de pellets in 2 ml warme DMEM.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie geresuspendeerde bacteriën is 1 x 108 CFU/ml.
  4. Vortex, voeg vervolgens 1 ml (1 x 108 CFU's) geresuspendeerd Shigella toe aan elk putje van de voorbereide HT-29 colonepitheliale monolagen in platen met 6 putjes (uit stap 3.2.10.2).
    OPMERKING: Infecties worden normaal gesproken uitgevoerd bij een multipliciteit van infectie (MOI; verhouding tussen bacteriële en epitheelcellen) van 100. Om verschillende MOI's te testen, verdunt u geresuspendeerd Shigella in warme DMEM tot de gewenste concentratie en voegt u vervolgens 1 ml verdunde bacteriën toe aan HT-29-monolagen. Om bijvoorbeeld een MOI van 10 te testen, verdunt u bacteriën 1:10 door 150 μL 1 x 108 CFU/ml bacteriën toe te voegen aan 1,35 ml warme DMEM en vervolgens 1 ml (1 x 107 CFU's) aan te brengen op HT-29-cellen.
  5. Incubeer de platen met 6 putjes bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 uur.
  6. Bepaal tijdens de incubatie de bacteriële infectietiter.
    1. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van geresuspendeerde Shigella-cellen (uit stap 4.3.3) in PBS.
    2. Plaat 100 μL van de 1 x 10-5 en 1 x 10-6 verdunningen op TSB + Congo rode platen en incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het plateren van 100 μL uit de verdunningen 1 x 10-5 en 1 x 10-6 komt overeen met een uiteindelijke verdunningsfactor van respectievelijk 1 x 10-6 en 1 x 10-7.
  7. Was de monolagen na incubatie 4-5x met PBS.
    1. Zuig media op uit elke put.
      NOTITIE: Bij het opzuigen van media van platen met 6 putjes, leidt u de punt van de aspirator langs de onderkant van de putjes en probeert u contact met de HT-29-cellen te vermijden.
    2. Voeg 1 ml warme PBS toe aan elk putje en was voorzichtig.
      NOTITIE: Om 6-well monolagen voorzichtig te wassen met PBS, beweegt u de plaat op en neer en heen en weer op het werkblad. Het wassen van platen in een cirkelvormige beweging en/of het verwijderen van de plaat van het werkblad kan leiden tot het mechanisch verwijderen van cellen uit plastic.
    3. Herhaal stap 4.7.1 en 4.7.2 nog 4x meerdere keren.
  8. Verwijder PBS door aspiratie en lyseer HT-29-cellen door 1 ml PBS + 1% Triton X-100 aan elk putje toe te voegen.
  9. Incubeer de platen met 6 putjes bij 37 °C gedurende 5 min.
  10. Gebruik een celschraper of een gebogen pipetpunt om de gelyseerde cellen van de bodem van het putje te schrapen en breng de volledige 1 ml over in een verse microcentrifugebuis van 1,7 ml.
  11. Bepaal het aantal cel-geassocieerde bacteriën.
    1. Draai elke buis (uit stap 4.10) gedurende ten minste 30 seconden om Shigella verder te verdringen van de gelyseerde eukaryote cellen.
    2. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van lysaten tot PBS.
    3. Plaat 100 μL van de 1 x 10-2, 1 x 10-3 en 1 x 10-4 verdunningen op TSB + Congo rode platen en incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het plateren van 100 μL uit de verdunningen 1 x 10-2, 1 x 10-3 en 1 x 10-4 komt overeen met een uiteindelijke verdunningsfactor van respectievelijk 1 x 10-3, 1 x 10-4 en 1 x 10-5.

5. Invasie test

OPMERKING: Alle volumes komen overeen met een test met behulp van twee platen met 6 putjes.

  1. Subcultuur van de ene op de andere dag Shigella-culturen via 1:50 verdunning in verse media.
    1. Vortex, voeg vervolgens 100 μL van elke nachtelijke cultuur toe aan 5 ml verse TSB of TSB + BS in een kweekbuis van de juiste grootte.
      NOTITIE: Beperk het kweekvolume tot <20% van het volume van de kweekkolf of buis om een goede beluchting te garanderen.
    2. Incubeer bij 37 °C met schudden bij 250 tpm totdat de cellen een OD600 van 0,7 bereiken (mid-log-fase van Shigella-groei ); ongeveer 2-2,5 uur.
      OPMERKING: Tijdens de subcultuur, aliquot 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamicine en een voldoende hoeveelheid PBS voor alle wasstappen en in een waterbad van 37 °C plaatsen. Laat media voor gebruik 37 °C bereiken.
  2. Breng 2 x 108 kve's gesubcultureerd Shigella over in individuele microcentrifugebuisjes van 2 ml.
    OPMERKING: 2 x 108 CFU's komt overeen met ongeveer 1 ml bacteriële cellen bij een OD600 van 0,7. Gebruik OD600-metingen om CFU/ml te benaderen volgens de kalibratie van elke afzonderlijke spectrofotometer.
  3. Was Shigella samples 1x met PBS.
    1. Pelletcellen door centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant op, voeg dan 1 ml warme PBS toe en resuspendeer de pellet goed, pipetter het monster voorzichtig op en neer totdat het mengsel volledig homogeen is (8-10x).
    2. Herhaal stap 5.3.1. 1x extra tijd.
    3. Pelletcellen centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, zuigen het supernatant op en resuspenderen de pellets in 2 ml warme DMEM.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie geresuspendeerde bacteriën is 1 x 108 CFU/ml.
  4. Vortex, voeg vervolgens 1 ml (1 x 108 CFU's) geresuspendeerd Shigella plus 1 ml DMEM toe aan elk putje van de voorbereide HT-29 colonepitheliale monolagen in platen met 6 putjes (uit stap 3.2.10.2).
    OPMERKING: Infecties worden normaal gesproken uitgevoerd bij een multipliciteit van infectie (MOI; verhouding tussen bacteriële en epitheelcellen) van 100. Om verschillende MOI's te testen, verdunt u geresuspendeerd Shigella in DMEM tot de gewenste concentratie en voegt u vervolgens 1 ml verdunde bacteriën toe aan HT-29-monolagen. Om bijvoorbeeld een MOI van 10 te testen, verdunt u bacteriën 1:10 door 150 μL 1 x 108 CFU/ml bacteriën toe te voegen aan 1,35 ml DMEM en voegt u vervolgens 1 ml (1 x 107 CFU's) toe aan HT-29-cellen.
  5. Om bacterieel contact met de HT-29-cellen te bevorderen, centrifugeert u de 6-wells platen bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur of 37 °C als de temperatuurinstelling kan worden aangepast.
    OPMERKING: Centrifugeren bevordert bacterieel contact met de HT-29-cellen, waardoor de noodzaak van hechtingsfactoren wordt omzeild en de bacteriën de cellen snel kunnen binnendringen.
  6. Incubeer platen met 6 putjes bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 45 min.
  7. Bepaal tijdens de incubatie de bacteriële infectietiter.
    1. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van geresuspendeerde Shigella-cellen (uit stap 5.3.3) in PBS.
    2. Plaat 100 μL van de 1 x 10-5 en 1 x 10-6 verdunningen op TSB + Congo rode platen en incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het plateren van 100 μL uit de verdunningen 1 x 10-5 en 1 x 10-6 komt overeen met een uiteindelijke verdunningsfactor van respectievelijk 1 x 10-6 en 1 x 10-7.
  8. Was geïnfecteerde HT-29-cellen 3x grondig met 1 ml PBS.
    1. Zuig media op uit elke put.
      NOTITIE: Bij het opzuigen van media van platen met 6 putjes, leidt u de punt van de aspirator langs de onderkant van de putjes en probeert u contact met de HT-29-cellen te vermijden.
    2. Voeg 1 ml warme PBS toe aan elk putje en was voorzichtig.
      NOTITIE: Om 6-well monolagen voorzichtig te wassen met PBS, beweegt u de plaat op en neer en heen en weer op het werkblad. Het wassen van platen in een cirkelvormige beweging en/of het verwijderen van de plaat van het werkblad kan leiden tot het mechanisch verwijderen van cellen uit plastic.
    3. Herhaal stap 5.8.1 en 5.8.2 nog 2x meer.
  9. Verwijder PBS door aspiratie, voeg vervolgens 2 ml warme DMEM aangevuld met 50 μg/ml gentamicine toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  10. Was geïnfecteerde HT-29-cellen 3x grondig met 1 ml PBS.
    1. Herhaal wasstap 5.8.
  11. Verwijder PBS door aspiratie, voeg vervolgens 2 ml warme DMEM aangevuld met 50 μg/ml gentamicine toe aan elk putje en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  12. Was geïnfecteerde HT-29-cellen 3x grondig met 1 ml PBS.
    1. Herhaal wasstap 5.8.
  13. Verwijder PBS door aspiratie en lyseer HT-29-cellen door 1 ml PBS + 1% Triton X-100 aan elk putje toe te voegen.
  14. Incubeer de platen met 6 putjes bij 37 °C gedurende 5 min.
  15. Gebruik een celschraper of een gebogen pipetpunt om de gelyseerde cellen van de bodem van het putje te schrapen en breng de volledige 1 ml over in een verse microcentrifugebuis van 1,7 ml.
  16. Bepaal het aantal intracellulaire bacteriën.
    1. Draai elke buis (uit stap 5.15) gedurende ten minste 30 seconden om Shigella verder te verdringen van de gelyseerde eukaryote cellen.
    2. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van lysaten tot PBS.
    3. Plaat 100 μL van de verdunningen 1 x 10-2 en 1 x 10-3 op TSB + Congo rode platen en incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het plateren van 100 μL uit de verdunningen 1 x 10-2 en 1 x 10-3 komt overeen met een uiteindelijke verdunningsfactor van respectievelijk 1 x 10-3 en 1 x 10-4.

6. Intracellulaire replicatietest

OPMERKING: Alle volumes komen overeen met een test met behulp van twee platen met 6 putjes.

  1. Subcultuur van de ene op de andere dag Shigella-culturen via 1:50 verdunning in verse media.
    1. Vortex, voeg vervolgens 100 μL van elke nachtelijke cultuur toe aan 5 ml verse TSB of TSB + BS in een kweekbuis van de juiste grootte.
      NOTITIE: Beperk het kweekvolume tot <20% van het volume van de kweekkolf of buis om een goede beluchting te garanderen.
    2. Incubeer bij 37 °C met schudden bij 250 tpm totdat de cellen een OD600 van 0,7 bereiken (mid-log-fase van Shigella-groei ); ongeveer 2-2,5 uur.
      OPMERKING: Tijdens de subcultuur, aliquot 50 ml DMEM + 50 mg/ml gentamicine en een voldoende hoeveelheid PBS voor alle wasstappen en in een waterbad van 37 °C plaatsen. Laat media voor gebruik 37 °C bereiken.
  2. Breng 2 x 108 kve's gesubcultureerd Shigella over in individuele microcentrifugebuisjes van 2 ml.
    OPMERKING: 2 x 108 CFU's komt overeen met ongeveer 1 ml bacteriële cellen bij een OD600 van 0,7. Gebruik OD600-metingen om CFU/ml te benaderen volgens de kalibratie van elke afzonderlijke spectrofotometer.
  3. Was Shigella samples 1x met PBS.
    1. Pelletcellen door centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant op, voeg dan 1 ml warme PBS toe en resuspendeer de pellet goed, pipetter het monster voorzichtig op en neer totdat het mengsel volledig homogeen is (8-10x).
    2. Herhaal stap 6.3.1. 1x extra tijd.
    3. Pelletcellen centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, zuigen het supernatant op en resuspenderen de pellets in 2 ml warme DMEM.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie geresuspendeerde bacteriën is 1 x 108 CFU/ml.
  4. Vortex, voeg vervolgens 1 ml (1 x 108 CFU's) geresuspendeerd Shigella plus 1 ml DMEM toe aan elk putje bereide HT-29 colonepitheliale monolagen in platen met 6 putjes (uit stap 3.2.10.2).
    OPMERKING: Infecties worden normaal gesproken uitgevoerd bij een multipliciteit van infectie (MOI; verhouding tussen bacteriële en epitheelcellen) van 100. Om verschillende MOI's te testen, verdunt u geresuspendeerd Shigella in DMEM tot de gewenste concentratie en voegt u vervolgens 1 ml verdunde bacteriën toe aan HT-29-monolagen. Om bijvoorbeeld een MOI van 10 te testen, verdunt u bacteriën 1:10 door 150 μL 1 x 108 CFU/ml bacteriën toe te voegen aan 1,35 ml DMEM en brengt u vervolgens 1 ml (1 x 107 CFU's) aan op HT-29-cellen.
  5. Om bacterieel contact met de HT-29-cellen te bevorderen, centrifugeert u de 6-wells platen bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur of 37 °C als de temperatuurinstelling kan worden aangepast.
    OPMERKING: Centrifugeren bevordert bacterieel contact met de HT-29-cellen, waardoor de noodzaak van hechtingsfactoren wordt omzeild en de bacteriën de cellen snel kunnen binnendringen.
  6. Incubeer platen met 6 putjes bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 45 min.
  7. Bepaal tijdens de incubatie de bacteriële infectietiter.
    1. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van geresuspendeerde Shigella-cellen (uit stap 6.3.3) in PBS.
    2. Plaat 100 μL van de 1 x 10-5 en 1 x 10-6 verdunningen op TSB + Congo rode platen en incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het plateren van 100 μL uit de verdunningen 1 x 10-5 en 1 x 10-6 komt overeen met een uiteindelijke verdunningsfactor van respectievelijk 1 x 10-6 en 1 x 10-7.
  8. Was geïnfecteerde HT-29-cellen 3x grondig met 1 ml PBS.
    1. Zuig media op uit elke put.
      NOTITIE: Bij het opzuigen van media van platen met 6 putjes, leidt u de punt van de aspirator langs de onderkant van de putjes en probeert u contact met de HT-29-cellen te vermijden.
    2. Voeg 1 ml warme PBS toe aan elk putje en was voorzichtig.
      NOTITIE: Om 6-well monolagen voorzichtig te wassen met PBS, beweegt u de plaat op en neer en heen en weer op het werkblad. Het wassen van platen in een cirkelvormige beweging en/of het verwijderen van de plaat van het werkblad kan leiden tot het mechanisch verwijderen van cellen uit plastic.
    3. Herhaal stap 6.8.1 en 6.8.2 nog 2x meer.
  9. Verwijder PBS door aspiratie, voeg vervolgens 2 ml warme DMEM aangevuld met 50 μg/ml gentamicine toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  10. Was geïnfecteerde HT-29-cellen 3x grondig met 1 ml PBS.
    1. Herhaal wasstap 6.8.
  11. Verwijder PBS door aspiratie, voeg vervolgens 2 ml warme DMEM met 50 μg/ml gentamicine toe aan elk putje van de 6-wells platen en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende de gewenste tijdsduur om intracellulaire replicatie mogelijk te maken (tot 24 uur).
  12. Was de cellen 2x grondig met 1 ml PBS.
    1. Herhaal wasstap 6.8.
  13. Verwijder PBS door aspiratie en lyseer HT-29-cellen door 1 ml PBS + 1% Triton X-100 aan elk putje toe te voegen.
  14. Incubeer de platen met 6 putjes bij 37 °C gedurende 5 min.
  15. Gebruik een celschraper of een gebogen pipetpunt om de gelyseerde cellen van de bodem van het putje te schrapen en breng de volledige 1 ml over in een verse microcentrifugebuis van 1,7 ml.
  16. Bepaal het aantal intracellulaire bacteriën.
    1. Draai elke buis (uit stap 6.15) gedurende ten minste 30 seconden om Shigella verder te verdringen van de gelyseerde eukaryote cellen.
    2. Bereid 10-voudige seriële verdunningen van lysaten tot PBS.
    3. Plaat 100 μL van de 1 x 10-2, 1 x 10-3 en 1 x 10-4 verdunningen op TSB + Congo Red platen en incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Het plateren van 100 μL uit de verdunningen 1 x 10-2, 1 x 10-3 en 1 x 10-4 komt overeen met een uiteindelijke verdunningsfactor van respectievelijk 1 x 10-3, 1 x 10-4 en 1 x 10-5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Therapietrouw-, invasie- en intracellulaire replicatietests werden uitgevoerd waarbij S. flexneri 2457T wildtype (WT) werd vergeleken met S. flexneri ΔVF (ΔVF), een mutant waarvan wordt verondersteld dat deze de virulentie van Shigella negatief reguleert. Aangezien Shigella galzouten gebruikt als signaal om virulentie te reguleren 17,18,47, werden experimenten uitgevoerd na bacteriële subcultuur in TSB-media en TSB aangevuld met 0,4% (w/v) galzouten 18. Blootstelling aan galzouten tijdens de subcultuurstap fungeert als een voorbehandeling om de transit van de dunne darm voorafgaand aan een darminfectie na te bootsen 17,18,47. Figuur 1 analyseert het effect van de ΔVF-mutatie op het vermogen van S. flexneri om zich te hechten aan HT-29 colonepitheelcellen. Het percentage therapietrouw wordt uitgezet op de y-as en vertegenwoordigt de verhouding van herstelde bacteriën na HT-29-lysis, gestandaardiseerd op het aantal inputbacteriën. Zoals verwacht hadden zowel S. flexneri WT- als ΔVF-stammen een significante toename van de therapietrouw bij subcultuur met galzoutsuppletie in vergelijking met TSB zonder suppletie met galzouten18. Er was echter geen verschil in therapietrouw aan HT-29-cellen tussen WT- en ΔVF-mutante stammen binnen elke subcultuuraandoening. Deze gegevens geven aan dat de ΔVF-mutatie geen effect heeft op het vermogen van S. flexneri om zich te hechten aan HT-29-epitheelcellen met of zonder de galzouten voorbehandeling.

In figuur 2 werd het effect van de ΔVF-mutatie op het vermogen van S. flexneri om binnen te dringen (Figuur 2A) en te repliceren (Figuur 2B) in HT-29 colonepitheelcellen met of zonder voorbehandeling van galzouten geanalyseerd. Het percentage herstel wordt uitgezet op de y-as en vertegenwoordigt de verhouding van herstelde bacteriële cellen na HT-29-cellyse, gestandaardiseerd op het aantal invoerbacteriën. In figuur 2A was er een verwachte significante toename van het vermogen van WT S. flexneri 2457T om HT-29-cellen binnen te dringen na pre-blootstelling aan galzouten48, terwijl de S. flexneri ΔVF-mutant een kleinere toename van invasie vertoonde na pre-blootstelling aan galzouten in vergelijking met de WT-stam. De ΔVF-mutant had een verhoogde invasiesnelheid van HT-29-cellen in vergelijking met de WT-subcultuur in TSB, maar had vergelijkbare invasiesnelheden als WT wanneer gesubcultiveerd in TSB aangevuld met galzouten (Figuur 2A). Deze resultaten suggereren dat de ΔVF-mutatie het vermogen van S. flexneri om HT-29-cellen binnen te dringen verbetert, wat het effect van de pre-blootstelling aan galzouten vermindert, hoewel het invasievermogen van de ΔVF-mutant verder toenam na de subcultuur van galzouten.

Over het algemeen werden 10 keer meer bacteriën teruggevonden na nachtelijke incubatie (Figuur 2B) in vergelijking met de incubatie van 90 minuten (Figuur 2A), wat de verschillen aantoont in respectievelijk het monitoren van intracellulaire groei versus invasie. Wanneer geïnfecteerde HT-29-cellen gedurende 18 uur werden geïncubeerd om intracellulaire replicatie van de bacteriën mogelijk te maken (Figuur 2B), nam de impact van de voorbehandeling van de galzouten af voor zowel de WT- als de ΔVF-stammen . Het verminderde effect van galzouten voorbehandeling tijdens intracellulaire replicatie was echter dramatischer voor de ΔVF-mutant . Aangezien de toename van de intracellulaire replicatie van beide stammen bij voorblootstelling aan galzouten kleiner was dan de toename van de invasiepercentages in dezelfde omstandigheden, veronderstellen we dat galzouten een grotere impact hebben op de vroege stappen in de pathogenese van S. flexneri . De ΔVF-mutant vertoonde een toename van het percentage herstel van nachtelijke replicatie in HT-29-cellen in vergelijking met WT (Figuur 2B) na beide subcultuuromstandigheden. Het percentage terugvorderingen van de ΔVF-mutant was echter vergelijkbaar, ongeacht de galzouten vóór blootstelling. Deze gegevenstrends suggereren dat de ΔVF-mutant efficiënter repliceert in HT-29-cellen in vergelijking met WT, en dat galzouten vóór blootstelling geen invloed hebben op het vermogen van de ΔVF-mutant om intracellulair te repliceren, zoals waargenomen voor WT (Figuur 2B). Aangezien het verschil tussen de mutante en WT-stammen in de pre-blootstellingstoestand van galzouten niet werd waargenomen tijdens de 90 minuten durende invasietest, veronderstellen we dat het product dat wordt gecodeerd door het verwijderde VF-gen ook de replicatie van S. flexneri in HT-29-cellen kan reguleren. Gecombineerd tonen beide analyses aan dat de ΔVF-mutant virulenter is ten opzichte van WT, wat suggereert dat het VF-genproduct een negatieve regulator is van S. flexneri-virulentie .

Figure 1
Figuur 1: Galzouten vóór blootstelling geïnduceerde hechting van S. flexneri aan HT-29-cellen. S. flexneri 2457T WT- en ΔVF-mutante cellen werden gesubcultureerd in TSB- of TSB-media, aangevuld met 0,4% (w/v) galzouten (TSB+BS) media. De bacteriën werden vervolgens toegepast op HT-29-cellen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 100 en gedurende 3 uur geïncubeerd om de therapietrouw te onderzoeken. Na incubatie werden geïnfecteerde HT-29-cellen gewassen en gelyseerd, en seriële verdunningen van herstelde bacteriën werden geplateerd om kolonievormende eenheden per ml (CFU/ml) op te sommen. Het aantal aanhangende bacteriën wordt uitgezet ten opzichte van de titers van de invoerbacteriën om het percentage therapietrouw vast te stellen. De gegevens zijn representatief voor één biologische replicatie met drie technische replicaten (individuele stippen). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) aan. Statistische significantie werd bepaald door de t-toets van een student (*p < 0,05; ***p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Galzouten vóór blootstelling verhoogden de invasie van WT S. flexneri en intracellulaire replicatie. S. flexneri 2457T WT- en ΔVF-mutante cellen werden gesubcultureerd in TSB- of TSB-media, aangevuld met galzouten (TSB+BS). De bacteriën werden vervolgens aangebracht op HT-29-cellen met een MOI van 100, gecentrifugeerd op de cellen en geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 45 minuten. Cellen werden gewassen met PBS en extracellulaire bacteriën werden gelyseerd door toevoeging van gentamicine aan de DMEM om uitsluitend intracellulaire bacteriën te herstellen. Na incubaties van 90 minuten (A, bacteriële invasie) of 18 uur (B, intracellulaire replicatie) werden geïnfecteerde HT-29-cellen gewassen en gelyseerd, en seriële verdunningen van teruggewonnen bacteriën werden geplateerd om kolonievormende eenheden per ml (CFU/ml) op te sommen. Het aantal intracellulaire bacteriën wordt uitgezet ten opzichte van de bacteriële titers om het percentage herstel vast te stellen. De gegevens zijn representatief voor één biologische replicaat, elk met drie technische replicaten (individuele stippen). Foutbalken geven SEM aan. Statistische significantie werd bepaald door de t-toets van een student (*p < 0,05). Let op de verschillen in de y-as schalen tussen panelen (A) en (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een reeks van drie gestandaardiseerde assays om Shigella-adhesie, invasie en intracellulaire replicatie van darmepitheelcellen te bestuderen. Hoewel deze methoden slechts aangepaste versies zijn van klassieke gentamicine-assays die worden gebruikt om de invasie en intracellulaire replicatie van verschillende bacteriële pathogenen in gastheercellen te bestuderen 49,50,51, moeten speciale overwegingen worden toegepast bij het bestuderen van Shigella.

Shigella zijn facultatieve anaëroben, die optimaal groeien bij 37 °C in een rijk medium met beluchting43. Bij het uitvoeren van deze tests om de effecten van verschillende omgevingssignalen of metabolieten op Shigella-infecties te onderzoeken, wordt aanbevolen om Shigella 's nachts in rijke media te laten groeien en vervolgens te subcultureren in gedefinieerde of gesupplementeerde media tot halverwege de logfase voorafgaand aan infectie. Maximale virulentie-genexpressie vindt plaats tijdens de logaritmische groeifase 52,53. Het subcultiveren van Shigella-culturen van de ene op de andere dag en het toestaan van bacteriegroei tot een exponentiële fase (OD600 ~ 0,7) zijn dus noodzakelijke stappen om de virulentie van Shigella goed te beoordelen. Verder is virulentiegenexpressie temperatuurafhankelijk. Om alleen tijdens gastheerinfectie specifiek tot expressie te komen, worden virulentiegenen geïnduceerd bij fysiologische temperaturen van de gastheer (37 °C) en strikt onderdrukt bij lagere temperaturen (bijv. 30 °C)54. Om de expressie van virulentiegenen te garanderen, moeten bacteriële subcultuur en infecties worden uitgevoerd bij 37 °C, met de nodige zorg om ervoor te zorgen dat de temperatuur niet onder 37 °C daalt. Een groot virulentieplasmide van 220 kilobase, dat codeert voor de moleculaire machinerie die nodig is voor invasie en epitheelcelinfectie, is een essentiële virulentiedeterminant voor alle Shigella spp5. Herhaalde passaging en langdurige groei bij 37 °C bevorderen virulentie plasmide-instabiliteit, wat resulteert in plasmideverlies en Shigella-cellen avirulent maakt55. Om het onderhoud van virulentieplasmide en de expressie van cruciale virulentiegenen te garanderen, wordt aanbevolen om bacteriën om de twee weken rechtstreeks uit de diepvriesvoorraden opnieuw te plaatsen op verse TSB + Congo rode indicatorplaten. Congo rode agar kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen wild-type virulente (rood, CR+) kolonies en avirulente (witte, CR-) kolonies die het virulentieplasmide45 hebben verloren. Als virulentieplasmide-instabiliteit herhaaldelijk wordt waargenomen, kunnen 's nachts culturen van Shigella worden geïncubeerd bij 30 °C om virulentieplasmideverlies te voorkomen, gevolgd door subculturatie bij 37 °C om virulentiegenexpressie te bevorderen43. Ten slotte, als analyses met mutanten en/of gecomplementeerde stammen worden uitgevoerd, waarbij antibiotische markers aanwezig zijn in deze bacteriestammen, wordt aanbevolen om de juiste antibioticaselectie te gebruiken tijdens de bacteriële nacht- en subculturatiestappen.

Het gebruik van HT-29 epitheliale monolagen heeft veel voordelen voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van Shigella-pathogenese in vitro. Aangezien Shigella een aan de mens aangepaste ziekteverwekker is, geven modellen van kleine dieren de karakteristieke pathogenese van shigellose die bij mensen wordt waargenomen niet nauwkeurigweer36. Het gebruik van gestandaardiseerde protocollen voor infectie van van mensen afkomstige cellijnen maakt het dus mogelijk om de afzonderlijke stappen van bacteriële pathogenese kwantitatief te ondervragen om het moleculaire samenspel tussen deze ziekteverwekker en zijn oorspronkelijke gastheer te karakteriseren. Historisch gezien werden HeLa-cellen voornamelijk gebruikt om gastheer-pathogeen interacties in vitro te bestuderen 25,56,57. HeLa-cellen zijn echter een onsterfelijke baarmoederhalskankercellijn, die niet-inheemse gastheercellen zijn voor darmbacteriële pathogenen. Zo zijn in vitro studies van enterische pathogenese verschoven naar het gebruik van adenocarcinoomcellijnen in de dikke darm (bijv. HT-29, Caco-2 en T84), die de morfologie van het darmepitheel getrouwer recapituleren en op transwells kunnen worden gekweekt als epitheliale monolagen met gedifferentieerde apicale en basolaterale oppervlakken 58,59,60. Hoewel elke cellijn zijn individuele sterke en zwakke punten heeft, worden HT-29-cellen gebruikt in de hier beschreven tests vanwege fenotypische overeenkomsten met intestinale enterocyten en robuuste expressie van celoppervlakreceptoren en pro-inflammatoire cytokines 58,59,61. Elk van deze besproken modellen zijn echter van kanker afgeleide cellijnen met afwijkende metabole en groeifenotypes die de natuurlijke fysiologische toestand van het colonepitheel in vivo niet nauwkeurig weergeven 58. Recente ontwikkelingen in menselijke weefselkweektechnieken hebben het mogelijk gemaakt om menselijke darmstamcellen, verkregen uit weefselbiopten, te kweken tot organoïden of enkele tweedimensionale celmonolagen die de verschillende celtypen in het menselijke maagdarmkanaal (GI) samenvatten 62,63,64. Intestinale organoïden kunnen worden gedifferentieerd met enterocyten, slijmproducerende bekercellen, M-cellen en andere weefselspecifieke celtypen. Recente studies hebben het gebruik van deze organoïdemodellen gevalideerd voor het bestuderen van darmpathogenen, waaronder verschillende Shigella spp., Salmonella enterica en Escherichia coli pathovars 62,63,64. Hoewel organoïden nauwkeurigere modellen zijn van het menselijke GI-epitheel en zelfs kunnen worden gekweekt in verschillende voedingsomstandigheden om de wereldbevolking te vertegenwoordigen65, vereist hun relatieve complexiteit aanzienlijke training en technische expertise, wat resulteert in hogere kosten en langere kweektijden in vergelijking met traditionele kankercellijnen58.

Dit protocol beschrijft medium-throughput-methoden, waarbij twee platen met 6 putjes worden gebruikt voor een totaal van 12 monolagen die beschikbaar zijn om te testen. Experimenten kunnen echter gemakkelijk worden opgeschaald om het aantal gezaaide monolagen te vergroten om extra technische replicaten mogelijk te maken, of om extra Shigella-mutanten en omgevingssignalen te testen. Weefselkweekplaten met meer putjes (bijv. platen met 12 of 24 putjes) kunnen ook worden gebruikt met de juiste aanpassingen om rekening te houden met putjes met kleinere diameters. Onder de in stap 3.2 beschreven HT-29-groeiomstandigheden zijn HT-29-titers voldoende voor het zaaien van ongeveer zes platen met 6 putjes na de kweek uit één T75-kolf, met voldoende resterende cellen om de HT-29-celkweek in stand te houden. Verder zijn het zaaien van HT-29-monolagen en de voorbereiding van inoculerende bacteriestappen identiek tussen bacteriële adherentie-, invasie- en intracellulaire replicatietests. Zo kunnen tests die dezelfde Shigella-stammen of subculturing-omstandigheden testen, gemakkelijk parallel worden uitgevoerd om tegelijkertijd de rol van elke experimentele aandoening in verschillende stappen van Shigella-infectie te onderzoeken.

Hersteltiters voor adherente (stap 4), binnengedrongen (stap 5) en intracellulaire bacteriën (stap 6) worden bepaald door seriële verdunningen van geïnfecteerde HT-29-cellen na lysis uit te plateren, wat een kwantitatieve beoordeling van de efficiëntie van elk stadium van Shigella-infectie mogelijk maakt. De centrifugatiestappen in de invasie- en intracellulaire replicatietests, gebaseerd op klassieke tests 49,50,51, bevorderen bacterieel contact met de gastheercellen voor onmiddellijke invasie en verhogen de invasiesnelheden. Centrifugeren "slaat" dus de therapietrouwstap over, waarvan later werd ontdekt dat het een belangrijk aspect was van Shigella-infectie 17,18,19,66. Het is essentieel op te merken dat de centrifugestap niet kan worden uitgevoerd met gepolariseerde epitheelcellen die op transwells zijn gezaaid. Voor de adherence-test wordt de adhesie echter niet afgedwongen door centrifugatie en wordt er geen gentamicine toegevoegd aan de geïnfecteerde HT-29-cellen voorafgaand aan lysis, waardoor de telling van aanhangende bacteriële cellen mogelijk is. Het volume weefselkweekmedia wordt teruggebracht tot 1 ml (in tegenstelling tot 2 ml voor de invasie- en intracellulaire replicatietests) om een efficiënter contact van de bacteriën met de HT-29-cellen mogelijk te maken. Bovendien kan, afhankelijk van de mate van therapietrouw, enige invasie en intracellulaire replicatie optreden tijdens de incubatie van 3 uur, maar de hoeveelheid is doorgaans te verwaarlozen (bijv. slechts 0,05% van de herstelde bacteriepopulatie na lyse van de gastheercel). Desalniettemin, om goed rekening te houden met adhesieve versus intracellulaire bacteriën tijdens de incubatie van 3 uur, wordt aanbevolen om parallelle tests uit te voeren, waarbij, naast het vermelde protocol, een tweede plaat wordt geïncubeerd met 50 μg/ml gentamicine in 2 ml DMEM per putje gedurende 45 minuten in totaal (15 min incubatie, wassen, verse DMEM + gentamycine gedurende 30 minuten) om extracellulaire bacteriën grondig te lyseren. Na HT-29-cellyse zoals vermeld in het protocol, kunnen de intracellulaire bacteriën worden opgesomd zoals hierboven vermeld, en vertegenwoordigen ze het aantal bacteriën dat is binnengedrongen. Deze waarde kan vervolgens worden afgetrokken van de bacteriën die van de plaat zijn opgesomd zonder behandeling met gentamicine om de aanhangende en binnengedrongen bacteriën op de juiste manier te bepalen. Parallelle analyses kunnen ook worden uitgevoerd om meer inzicht te krijgen in de intracellulaire replicatie van Shigella in HT-29-cellen na invasie, bijvoorbeeld door meerdere tijdstippen te gebruiken om intracellulaire groeicurven uit te voeren. Ten slotte kunnen, samen met het opsommen van intracellulaire bacteriën na een 18 uur gentamicine-incubatie, de kweeksupernatanten worden verzameld en geanalyseerd op cytokinesecretie van geïnfecteerde HT-29-cellen. IL-8 is bijvoorbeeld een chemokine die wordt uitgescheiden door epitheelcellen en die grotendeels functioneert om PMN's te rekruteren naar de plaats van infectie. De hoeveelheid IL-8 die wordt uitgescheiden in de kweekmedia van geïnfecteerde HT-29-cellen kan worden geanalyseerd met een IL-8 ELISA-test67.

Galzouten hebben bewezen een belangrijk virulentiesignaal te zijn voor Shigella tijdens de doorvoer door het menselijke maagdarmstelsel, en kunnen worden gebruikt om bacteriële groeimedia in deze protocollen aan te vullen om typische gastro-intestinale omstandigheden na te bootsen. Van nature worden galzouten in de twaalfvingerige darm of het bovenste deel van de dunne darm geïntroduceerd om de spijsvertering te bevorderen; En in het terminale ileum of het einde van de dunne darm wordt 95% van de galzouten verwijderd en weer in de circulatie gerecycled voor de uiteindelijke afzetting in de galblaas68. Galzouten hebben meestal een concentratie tussen 0,2%-2,0% (w/v) in de dunne darm en zijn van nature bacteriedodend. Shigella is echter, samen met de meeste darmbacteriën, bestand tegen galzouten en gebruikt de signalen om de infectie te versterken47. Verschillende onderzoeken hebben gedocumenteerd hoe blootstelling aan galzouten, soms in combinatie met andere signalen van de dunne darm zoals glucose, de overleving van Shigella en de virulentieregulatie voorafgaand aan infectie beïnvloedt. Van Shigella is aangetoond dat het bestand is tegen galzouten, de genexpressie verandert en een biofilm vormt en verspreidt in omstandigheden die de transit van de dunne darm reproduceren17,69. De studies hebben aangetoond dat deze veranderingen resulteren in een hypervirulent fenotype, waarbij therapietrouw en invasie worden geïnduceerd bij een daaropvolgende coloninfectie door Shigella 17,18,19,48,66. De hierboven geschetste voorwaarden documenteren dus hoe Shigella in galzouten kan worden gesubcultureerd om de transit van de dunne darm na te bootsen voorafgaand aan het uitvoeren van de therapietrouw-, invasie- of intracellulaire replicatietests. De gespecificeerde TSB-formulering bevat toegevoegde glucose ten opzichte van typische Luria-bouillon (LB)17. Als LB wordt gebruikt, is het dus belangrijk om ook de media aan te vullen met glucose (0,5%-2,0% [w/v]) om de glucosesignalen in de dunne darm op de juiste manier te beschouwen17. Bovendien worden, zoals hierboven vermeld, alle Shigella-subculturen gewassen om galzouten te verwijderen en de overgang naar de dikke darm na te bootsen voor infectieanalyses.

Traditioneel, en zoals benadrukt in de bovenstaande resultaten (Figuur 1 en Figuur 2), zijn infectietests waardevol om de rol van een bepaald gen bij Shigella-infectie te bepalen. Het fenotype van verschillende mutanten kan echter niet echt worden gewaardeerd zonder de juiste aanvulling van de bacteriële kweekmedia. Zoals eerder onderzoek heeft aangetoond, veranderen galzouten de genexpressie van S. flexneri aanzienlijk, inclusief genen voor centraal metabolisme, transcriptiefactoren, suikertransporters, resistentie tegen geneesmiddelen en virulentiegenen die ofwel gecodeerd zijn op het chromosoom of virulentieplasmide17. Deze genen geven inzicht in hoe Shigella galzouten gebruikt als een signaal om de genexpressie te veranderen en zich voor te bereiden op een eventuele infectie van de dikke darm, en daaropvolgende mutatieanalyses moeten dus worden uitgevoerd in de juiste gesupplementeerde bacteriële groeimedia voordat de effecten op virulentie in de therapietrouw, invasie en intracellulaire replicatietesten worden onderzocht. Zoals hierboven te zien is in figuur 1 en figuur 2, had de ΔVF-mutatie geen invloed op therapietrouw, maar wel op invasie en intracellulaire replicatie. Omdat de mutatie de invasie en intracellulaire replicatie versterkte, zijn er momenteel experimenten aan de gang om te bepalen hoe het genproduct de infectie reguleert. De mutantenanalyses dienen als een voorbeeld van hoe nieuwe inzichten in de pathogenese van Shigella kunnen worden bestudeerd, vooral in omstandigheden die het menselijke maagdarmkanaal beter nabootsen. Goede complementatieanalyses worden aanbevolen om de fenotypes van verschillende mutanten te valideren.

In combinatie beschrijven deze procedures kwantitatieve experimenten die belangrijk inzicht zullen verschaffen in de moleculaire mechanismen van Shigella-aanhankelijkheid, invasie van en replicatie in HT-29 colonepitheelcellen door de natuurlijke omgeving van het menselijke maagdarmkanaal tijdens infectie zo goed mogelijk na te bootsen. Toekomstige studies kunnen de mutanten en experimentele omstandigheden uitbreiden om een beter begrip te krijgen van hoe Shigella zich voorbereidt op menselijke gastheren en deze effectief infecteert. Ondanks tientallen jaren van onderzoek is er nog zoveel meer te ontdekken over Shigella-infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgments

Ondersteuning voor de auteurs omvat de afdeling Kindergeneeskunde van het Massachusetts General Hospital, de Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF)-prijs 2022A009041, de subsidie van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases R21AI146405 en de National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases-subsidie Nutrition Obesity Research Center in Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm PES filter Millipore-Sigma SCGP00525 Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes Corning 352059 17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes Corning 430829 50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates Corning 3516 Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts Sigma-Aldrich B8756 1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye Sigma-Aldrich C6277 A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide Invitrogen C10283 To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 10569-010 DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135 Heat-inactivated, sterile
Gentamicin Sigma-Aldrich G3632 Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line ATCC HTB-38 Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film Bemis PM999 Laboratory sealing film
Petri dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713 100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 1x concentration; pH 7.4
Select agar Invitrogen 30391023 A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks Corning 430641U Tissue culture flasks
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stain Invitrogen T10282 A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB) Sigma-Aldrich T8907 Bacterial growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077 (2021).
  2. WHO. WHO methods and data sources for country-level causes of death 2000-2016. World Health Organization. , Geneva. (2018).
  3. Kotloff, K. L. Shigella infection in children and adults: a formidable foe. Lancet Glob Health. 5 (12), e1166-e1167 (2017).
  4. Kotloff, K. L., et al. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): A prospective, case-control study. Lancet. 382 (9888), 209-222 (2013).
  5. Schroeder, G. N., Hilbi, H. Molecular pathogenesis of Shigella spp.: Controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev. 21 (1), 134-156 (2008).
  6. Arvelo, W., et al. Transmission risk factors and treatment of pediatric shigellosis during a large daycare center-associated outbreak of multidrug resistant shigella sonnei: Implications for the management of shigellosis outbreaks among children. Pediatr Infect Dis J. 28 (11), 976-980 (2009).
  7. Kozyreva, V. K., et al. Recent outbreaks of Shigellosis in California caused by two distinct populations of Shigella sonnei with either increased virulence or fluoroquinolone resistance. mSphere. 1 (6), 1-18 (2016).
  8. Bowen, A., et al. Importation and domestic transmission of Shigella sonnei resistant to ciprofloxacin - United States, May 2014-February 2015. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 64 (12), 318-320 (2015).
  9. Tansarli, G. S., et al. Genomic reconstruction and directed interventions in a multidrug-resistant Shigellosis outbreak in Seattle, WA, USA: a genomic surveillance study. Lancet. 3099 (22), 1-11 (2023).
  10. Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  11. Increase in Extensively Drug-Resistant Shigellosis in the United States. CDC Health Alert Network. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://emergency.cdc.gov/han/2023/han00486.asp?ACSTrackingID=USCDC_511-DM100260&ACSTrackingLabel=HAN%20486%20-%20General%20Public&deliveryName=USCDC_511-DM100260 (2023).
  12. Shiferaw, B., et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010. Clin Infect Dis. 54, S458-S463 (2012).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19: U.S. Impact on Antimicrobial Resistance, Special Report 2022. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services. CDC. , (2022).
  14. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. CDC. 10 (1), Atlanta, Georgia. (2019).
  15. WHO. Prioritization of pathogens to guide discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. WHO. , Geneva. (2017).
  16. DuPont, H. L., Levine, M. M., Hornick, R. B., Formal, S. B. Inoculum size in shigellosis and implications for expected mode of transmission. J Infect Dis. 159 (6), 1126-1128 (1989).
  17. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), 1-18 (2017).
  18. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  19. Chanin, R. B., et al. Shigella flexneri adherence factor expression in in vivo-like conditions. mSphere. 4 (6), e00751 (2019).
  20. Baranov, V., Hammarström, S. Carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1), apically expressed on human colonic M cells, are potential receptors for microbial adhesion. Histochem Cell Biol. 121 (2), 83-89 (2004).
  21. Wassef, J. S., Keren, D. F., Mailloux, J. L. Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal loop model of shigellosis. Infect Immun. 57 (3), 858-863 (1989).
  22. Sansonetti, P. J., Arondel, J., Cantey, J. R., Prévost, M. C., Huerre, M. Infection of rabbit Peyer's patches by Shigella flexneri: Effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium. Infect Immun. 64 (7), 2752-2764 (1996).
  23. Sansonetti, P. J., et al. Caspase-1 activation of IL-1beta and IL-18 are essential for Shigella flexneri-induced inflammation. Immunity. 12 (5), 581-590 (2000).
  24. Zychlinsky, A., Fitting, C., Cavaillon, J. M., Sansonetti, P. J. Interleukin 1 is released by murine macrophages during apoptosis induced by Shigella flexneri. J Clin Invest. 94 (3), 1328-1332 (1994).
  25. Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51 (2), 461-469 (1986).
  26. Maldonado-Contreras, A., et al. Shigella depends on SepA to destabilize the intestinal epithelial integrity via cofilin activation. Gut Microbes. 8 (6), 544-560 (2017).
  27. Collard, J. -M., et al. High prevalence of small intestine bacteria overgrowth and asymptomatic carriage of enteric pathogens in stunted children in Antananarivo, Madagascar. PLoS Negl Trop Dis. 16 (5), e0009849 (2022).
  28. Mattock, E., Blocker, A. J. How do the virulence factors of shigella work together to cause disease. Front Cell Infect Microbiol. 7, 1-24 (2017).
  29. Mostowy, S., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri interaction with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS Pathog. 9 (9), e1003588 (2013).
  30. Martinez-Becerra, F. J., et al. Parenteral immunization with IpaB/IpaD protects mice against lethal pulmonary infection by Shigella. Vaccine. 31 (24), 2667-2672 (2013).
  31. Shim, D. -H., et al. New animal model of shigellosis in the Guinea pig: its usefulness for protective efficacy studies. J Immunol. 178 (4), Baltimore, Md. 2476-2482 (2007).
  32. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  33. West, N. P., et al. Optimization of virulence functions through glucosylation of Shigella LPS. Science. 307 (5713), 1313-1317 (2005).
  34. Maurelli, A. T., et al. Shigella infection as observed in the experimentally inoculated domestic pig, Sus scrofa domestica. Microbial Pathog. 25 (4), 189-196 (1998).
  35. Jeong, K. -I., Zhang, Q., Nunnari, J., Tzipori, S. A piglet model of acute gastroenteritis induced by Shigella dysenteriae Type 1. J Infect Dis. 201 (6), 903-911 (2010).
  36. Kim, Y. -J., Yeo, S. -G., Park, J. -H., Ko, H. -J. Shigella vaccine development: prospective animal models and current status. Curr Pharm Biotechnol. 14 (10), 903-912 (2013).
  37. Kent, T. H., Formal, S. B., LaBrec, E. H., Sprinz, H., Maenza, R. M. Gastric shigellosis in rhesus monkeys. Am J Pathol. 51 (2), 259-267 (1967).
  38. Shipley, S. T., et al. A challenge model for Shigella dysenteriae 1 in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis). Comp Med. 60 (1), 54-61 (2010).
  39. Higgins, R., Sauvageau, R., Bonin, P. Shigella flexneri Type 2 Infection in captive nonhuman primates. Can Vet J. 26 (12), 402-403 (1985).
  40. Oaks, E. V., Hale, T. L., Formal, S. B. Serum immune response to Shigella protein antigens in rhesus monkeys and humans infected with Shigella spp. Infect Immun. 53 (1), 57-63 (1986).
  41. Formal, S. B., et al. Protection of monkeys against experimental shigellosis with a living attenuated oral polyvalent dysentery vaccine. J Bacteriol. 92 (1), 17-22 (1966).
  42. Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nat Rev Microbiol. 5 (7), 540-553 (2007).
  43. Payne, S. M. Laboratory cultivation and storage of Shigella. Curr Protoc Microbiol. 55 (1), 93 (2019).
  44. NIH Guidelines. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. NIH Guidelines. 2, 142 (2019).
  45. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  46. HT-29 cell line product sheet. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/products/htb-38 1-6 (2023).
  47. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), 819-836 (2016).
  48. Stensrud, K. F., et al. Deoxycholate interacts with IpaD of Shigella flexneri in inducing the recruitment of IpaB to the type III secretion apparatus needle tip. J Biol Chem. 283 (27), 18646-18654 (2008).
  49. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J Clin Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
  50. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymo. 236 (1979), 405-420 (1994).
  51. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62 (8), 3463-3471 (1994).
  52. Dorman, C. J., McKenna, S., Beloin, C. Regulation of virulence gene expression in Shigella flexneri, a facultative intracellular pathogen. Int J Med Microbiol. 291 (2), 89-96 (2001).
  53. Porter, M. E., Dorman, C. J. Positive regulation of Shigella flexneri virulence genes by integration host factor. J Bacteriol. 179 (21), 6537-6550 (1997).
  54. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Temperature-dependent expression of virulence genes in Shigella species. Infect Immun. 43 (1), 195-201 (1984).
  55. Schuch, R., Maurelli, A. T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression. Infect Immun. 65 (9), 3686-3692 (1997).
  56. Formal, S. B., Hale, T. L., Sansonetti, P. J. Invasive enteric pathogens. Rev Infect Dis. 5, S702-S707 (1983).
  57. Pál, T., Hale, T. L. Plasmid-associated adherence of Shigella flexneri in a HeLa cell model. Infect Immun. 57 (8), 2580-2582 (1989).
  58. Noben, M., et al. Human intestinal epithelium in a dish: Current models for research into gastrointestinal pathophysiology. United European Gastroenterol J. 5 (8), 1073-1081 (2017).
  59. Liévin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiol Mol Biol Rev R. 77 (3), 380-439 (2013).
  60. Mitchell, D. M., Ball, J. M. Characterization of a spontaneously polarizing HT-29 cell line, HT-29/cl.f8. In Vitro Cell Dev Biol - Anim. 40 (10), 297-302 (2004).
  61. Gagnon, M., Zihler Berner, A., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. J Microbiol Methods. 94 (3), 274-279 (2013).
  62. Koestler, B. J., et al. Human intestinal enteroids as a model system of Shigella pathogenesis. Infect Immun. 87 (4), 00733 (2019).
  63. Ranganathan, S., et al. Evaluating Shigella flexneri pathogenesis in the human enteroid model. Infect Immun. 87 (4), (2019).
  64. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiol Spectr. 9 (1), 1-17 (2021).
  65. Perlman, M., Senger, S., Verma, S., Carey, J., Faherty, C. S. A foundational approach to culture and analyze malnourished organoids. Gut Microbes. 15 (2), 2248713 (2023).
  66. Pope, L. M., Reed, K. E., Payne, S. M. Increased protein secretion and adherence to HeLa cells by Shigella spp. following growth in the presence of bile salts. Infect Immun. 63 (9), 3642-3648 (1995).
  67. Faherty, C. S., et al. The synthesis of OspD3 (ShET2) in Shigella flexneri is independent of OspC1. Gut Microbes. 7 (6), 486-502 (2016).
  68. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  69. Köseoğlu, V. K., Hall, C. P., Rodríguez-López, E. M., Agaisse, H. The Autotransporter IcsA promotes Shigella flexneri biofilm formation in the presence of bile salts. Infect Immun. 87 (7), 1-14 (2019).

Tags

Immunologie en infectie nummer 204 Shigella therapietrouw invasie intracellulaire replicatie pathogenese virulentiefactoren epitheelcellen galzouten
Epitheelcelinfectieanalyses met <em>Shigella</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, … More

Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (204), e66426, doi:10.3791/66426 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter