Parring og æg iscenesættelse: En metode til at generere embryoner og sortere dem efter udviklingsstadium

Overview

Artiklen beskriver en protokol til at generere zebrafisk embryoner gennem naturlige parring og sortering deres udviklingsstadier. Protokollen anvendes yderligere til analyse af bugspytkirtel β-celler ved hjælp af transgene fisk.

Protocol

1. Generering af embryoner gennem naturlig parring

1. Kulturfostre til 3 måneder, reproduktiv modenhed.
2. Adskille voksne mandlige og kvindelige fisk fra den ønskede stamme i opdelt parring tanke om aftenen før embryon indsamling, og tilsæt 2 hanner og 3 hunner til hver tank.
   BEMÆRK:Brug af den transgene insulin2a:mCherry fluorescerende reporter stamme tilladt analyse af bugspytkirtel β-celler.
3. Overfør fisk til parringstanken med ferskvand, og fjern skillevæggen umiddelbart efter, at lysene tændes den følgende morgen.
4. Lad fisken parre sig naturligt, indtil embryoner observeres i bundtanken. Saml embryoner i 30 minutters intervaller, indtil den ønskede mængde er indsamlet. Hvert indsamlet tidspunkt opbevares i separate petriskåle i embryomedier ved 28,5 °C.
5. Udfør mikroinjektion af genetisk materiale eller placering i eksperimentelle kulturmedier, hvis det ønskes, og kultur embryonerne i frisk Hanks embryomedium i 10 cm Petri-retter ved 28,5 °C.
   BEMÆRK:Ved analyse af genekspression i morpholino (MO) injicerede eller mutante dyr skal det bemærkes, at hver manipulation kan have utilsigtede virkninger på genekspressionen. Mutanter kan udvise genetisk kompensation på transskriberingsniveau, der ikke observeres af MO-baseret genmålretning.

2. Scenefostre

1. Kultur embryonerne i grupper på 50-75 embryoner pr. 10 cm petriskål for at fremme konsekvent udviklingsmæssig timing af alle embryoner.
2. Overvåg den udviklingsmæssige morfologi ved hjælp af dissekere mikroskop på blastomere, epiboly, og somite faser for at sikre udviklingsmæssige progression.
   BEMÆRK:Fjern alle døende eller misdannede embryoner for at undgå udviklingsforsinkelse i fadet.
3. Adskil embryonerne baseret på udviklingsalderen. Scene embryoner og larver ved hjælp af den samlede kropslængde efter 24 hkf.
   BEMÆRK:Somitterne er det chevronformede mesodermale væv, der er til stede på den dorsale del af embryoet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss