Accoppiamento e messa in scena delle uova: un metodo per generare embrioni e ordinarli per fase di sviluppo

Overview

L'articolo descrive un protocollo per generare embrioni di zebrafish attraverso l'accoppiamento naturale e lo smistamento delle loro fasi di sviluppo. Il protocollo viene ulteriormente utilizzato per l'analisi delle cellule β pancreatiche utilizzando pesci transgenici.

Protocol

1. Generare embrioni attraverso l'accoppiamento naturale

1. Embrioni di coltura fino a 3 mesi di età, maturità riproduttiva.
2. Separare i pesci adulti maschi e femmine dal ceppo desiderato in serbatoi di accoppiamento divisi la sera prima della raccolta degli embrioni e aggiungere 2 maschi e 3 femmine a ogni serbatoio.
   NOTA: L'uso del ceppo reporter fluorescente transgenico insulin2a:mCherry ha permesso l'analisi delle cellule β pancreatiche.
3. Trasferire il pesce nel serbatoio di accoppiamento con acqua di sistema fresca e rimuovere il divisore immediatamente dopo che le luci si accese la mattina seguente.
4. Lasciare che il pesce si accoppia naturalmente fino a quando gli embrioni non vengono osservati nel serbatoio inferiore. Raccogliere embrioni a intervalli di 30 minuti fino a quando non viene raccolta la quantità desiderata. Conservare ogni punto di tempo raccolto in piastre di Petri separate in mezzi embrionale a 28,5 °C.
5. Eseguire la microiniezione di materiale genetico o il posizionamento in mezzi di coltura sperimentali, se lo si desidera, e colturare gli embrioni nel mezzo embrionale fresco di Hank in piatti petri da 10 cm a 28,5 °C.
   NOTA: Per l'analisi dell'espressione genica negli animali iniettati o mutanti del morfolino (MO), si noti che ogni manipolazione può avere impatti incidentali sull'espressione genica. I mutanti possono mostrare una compensazione genetica a livello di trascrizione che non è osservata dal targeting genico basato su MO.

2. Embrioni di stadio

1. Coltura gli embrioni in gruppi di 50-75 embrioni per piastra di Petri di 10 cm per promuovere tempi di sviluppo coerenti di tutti gli embrioni.
2. Monitorare la morfologia dello sviluppo usando il microscopio sezionato a stadi di blastomero, epiboly e somite per garantire la progressione dello sviluppo.
   NOTA: Rimuovere eventuali embrioni morenti o malformati per evitare ritardi nello sviluppo nel piatto.
3. Separare gli embrioni in base all'età dello sviluppo. Stadie gli embrioni e le larve utilizzando la lunghezza totale del corpo dopo 24 hpf.
   NOTA: I somiti sono il tessuto mesodermico a forma di gallone presente sulla parte dorsale dell'embrione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss