Summary
النموذج الحي
Abstract
نموذج الكائن وراثيا لين العريكة C. وقد وفرت ايليجانس نظرة ثاقبة عدد لا يحصى من الأسئلة البيولوجية، مكنت من وقته القصير جيل، وسهولة النمو وحجم صغير. هذا الحجم الصغير، على الرغم من وألغى عددا من النهج التقنية الموجودة في النظم نموذج آخر. على سبيل المثال، نقل الدم في أنظمة وتقنيات التطعيم الثدييات في محطات تمكين طرح الأسئلة من تكوين جهاز الدورة الدموية والإشارة. الدورة الدموية للدودة، وجوف عام كاذب، وحتى وقت قريب من المستحيل الفحص مباشرة. للإجابة على الأسئلة من إشارات بين الخلايا والدورة الدموية نظام تكوين C. تحولت الباحثين ايليجانس تقليديا للتحليل الجيني، خلية / الأنسجة الانقاذ محددة، وتحليل الفسيفساء. هذه التقنيات توفر وسيلة للاستدلال ما يحدث بين الخلايا، ولكنها ليست قابلة للتطبيق عالميا في مجال تحديد وتوصيف جزيئات خارج الخلية. هنا نقدم شمال شرقوضعت تقنية لفحص wly مباشرة من السائل pseudocoelomic C. ايليجانس. هذه التقنية تبدأ إما وراثية أو التلاعب المادية لزيادة حجم السائل خارج الخلية. بعد ذلك الحيوانات التي يتعرض لها لحقن مكروي مصاصة للدماء عكس تقنية باستخدام جهاز حقن مكروي التي تسمح غرامة السيطرة على ضغط التوازن. بعد عزل السوائل خارج الخلية، يمكن يعاير السائل جمعها عن طريق التحويل إلى حيوانات أخرى أو عن طريق الجزيئية. للتدليل على فعالية هذه التقنية نقدم نهج مفصل لفحص مثال محدد من الجزيئات خارج الخلية إشارة، الرنا المزدوج الجديلة الطويلة خلال استجابة رني النظامية. على الرغم من توصيف رني النظامية هو دليل على سبيل المثال مبدأ، ونحن نرى هذه التقنية بأنها قابلة للتكيف للرد على مجموعة متنوعة من الأسئلة من تكوين جهاز الدورة الدموية والإشارة.
Protocol
1. إعداد مواد
المواد اللازمة لحقن مكروي عكس مصاصة للدماء هي مماثلة لتلك المطلوبة لتقنيات حقن مكروي القياسية المستخدمة لجعل المعدلة وراثيا C. ايليجانس سلالات 1. على الرغم من إحراز بعض الكواشف (لوحات الفحص على سبيل المثال) في اليوم لنقل التجريبية، يجب أن يكون العديد من المواد التي أعدت coordinately على مدى فترة 8 يوم (أنظر الجدول 1 لجدول زمني). على هذا النحو، من المهم أن تخطط للمستقبل بعناية عند استخدام هذه التقنية (على الكواشف والمعدات اللازمة انظر الجدول 2).
حقن منصات:
- جعل حل الاغاروز 2٪ في H 2 O والحرارة حتى يذوب. قسامة في مأخوذة 1ML في 1.5 أنابيب microcentrifuge مل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- وضع 22 × غطاء 50 مم النظارات على قمة مقاعد البدلاء مع حوافها جاحظ قليلا قبالة الحافة مقاعد البدلاء الأعلى لتسهيل انتشالها بسرعة.
- بوكعصام ثقب صغير في الغطاء للأنبوب microcentrifuge (استخدام دبوس طبعة) للسماح التنفيس. وضع أنبوب في كوب مل 15 مع حوالي 5 مل من الماء، والميكروويف لإذابة (حوالي 35 ثانية).
- باستخدام ماصة باستور ومكان لمبة انخفاض (حوالي 35 ميكرولتر) من الاغاروز ذاب على الزجاج غطاء ووضعه على الفور الزجاج غطاء الثاني على انخفاض بزاوية 90 درجة إلى الأول. تكرار لعدة أكواب تغطية أخرى.
- بعد الاغاروز وقد عززت، وإزالة الزجاج غطاء والسماح لوحة للهواء الجاف ليلة وضحاها تماما (إذا لزم الأمر عاجلا، يمكن وضعها الشرائح في فرن 50-80 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة).
- ويمكن بعد ذلك منصات تكون مخزنة في غطاء صندوق زجاجي في درجة حرارة الغرفة لأجل غير مسمى.
فحص لوحات:
وينبغي لمعايرة أن يتم الفتك الجنينية المرتبطة PAL-1 رني، وإعداد لوحات الفحص في يوم التجربة مصاصة للدماء. والهدف من ذلك هو هكتارهاء العشب الحد الأدنى البكتيرية في حين لا تجويع الديدان الخاص بك. والعشب الكثيف بشكل مفرط يجعل سجل PAL-1 يرقات صعبة للغاية لأنها يمكن بسهولة، شفافة الحيوانات الصغيرة L1 مشوهة تضيع في الطعام. وينبغي أن يكون الأمثل إعداد لوحة لتسجيل النمط الظاهري في المصالح.
- إعداد OP50: مع مستعمرة OP50 واحدة نمت على لوحات أجار LB 5mLs البذور من مرق LB. احتضان OP50 عند 37 درجة مئوية خلال الليل بينما الهز، ثم تخزين في C. ° 4
- إعداد 35 لوحات NGM مم وفقا لالأساسية البروتوكول (انظر الملاحظة 1).
- سبوت 20 ميكرولتر من الثقافة OP50 بين عشية وضحاها (الخطوة 1.7) على كل لوحة NGM. السماح للLB-OP50 لتجف (هذا ينبغي أن تأخذ أقل من 20 دقيقة).
حقن الإبر:
- سحب الإبر الحقن من البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية باستخدام P97 المشتعلة / بني micropipette مجتذب من الصكوك سوتر (انظر الشكل 1 لشكل إبرة ممثل).
- متجر الحقنالإبر في حامل إبرة مصنوعة من لوحة بيتري والطين النمذجة (انظر 1).
2. إعداد الديدان
ويقدر حجم pseudocoelomic لC. الكبار ايليجانس خنثى هو 40-80 picoliters (بيرس كوم. ديفيد هول). للحصول على عينات من السائل خارج الخلية من خزان صغير مثل هذا فإنه من المفيد لزيادة الموارد الإجمالية المتاحة. حددنا ثلاث طرق لزيادة كبيرة في السائل المتاحة في الديدان المانحة. طريقة اهتمامنا الرئيسي يستغل النمط الظاهري من CLR-1 (e1745) المسوخ، والتي يمكن أن تسبب زيادة قدرها 10 أضعاف أو أكثر في حجم السائل خارج الخلية (الشكل 2). طريقتين بديلة الاستفادة من حقيقة أن حسابات سلالة الجرثومية ما يقرب من ثلث إجمالي حجم الدودة، وزواله من GLP-1 (رني) أو نتائج الاستئصال بالليزر في الحيوانات بسائل pseudocoelomic ملء الفراغ سلالة الجرثومية (الشكل 2) 2 </ سوب>.
إعداد الديدان المانحة باستخدام CLR-1 (e1745)
انظر الشكل 3 للCLR-1 (e1745) نقل سير العمل مقايسة
- خط من البكتيريا التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة للمستعمرات واحد على LB + 25μg/mL لوحات كربنيسيلين. سوف نستخدم PAL-1 البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة المنتجة لهذه التظاهرة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- من LB يشوبه + 25 ميكروغرام / مل كربنيسيلين لوحة من PAL-1 البكتيريا (رني)، واختيار مستعمرة واحدة لتطعيم ثقافة 3 مل بين عشية وضحاها في LB تستكمل مع كربنيسيلين 25μg/mL.
- ماصة 15 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها على لوحات NGM 35MM تستكمل مع 25 ميكروغرام / كربنيسيلين مل و 1 IPTG ملي. تأكد من لوحة البكتيريا قبالة وسط اللوحة. السماح ليجف (حوالي 20 دقيقة).
- جعل 500 ميكرولتر حل التبييض الطازجة (1:1 KOH 5M: NaHypochlorite).
- ماصة 10 ميكرولتر من محلول التبييض على لوحة المصنف. يكون ر متأكدس وضع قطرات التبييض بعيدا عن بقعة البكتيرية.
- للحصول على ونظيفة الصغيرة، والسكان متزامنة من CLR-1 (e1745) الحيوانات لحقن مكروي عكس، واختيار 2-10 البالغين حامل في انخفاض التبييض. من البالغين حل، وترك نظيفة، جزئيا نظم تنمويا الأجنة. وهذه الأجنة يفقس ثم واليرقات والزحف على الغذاء.
- احتضان لمدة أربعة أيام في درجة حرارة 20 º
- تحويل لوحات إلى 25 درجة مئوية لمدة أربع ساعات للحث على التورم.
- اختيار الديدان إلى لوحة NGM غير المصنف وإتاحة الوقت لمسح البكتيريا من بشرة. (خطوة اختيارية) شطف الديدان في M9 أثناء نقل لوحات NGM.
- نقل الديدان L4/Young الكبار المتلقي (YA) إلى لوحة لوحة NGM غير المصنف وإتاحة الوقت لمسح البكتيريا من بشرة. (خطوة اختيارية) شطف الديدان في M9 أثناء نقل لوحات NGM.
A2) إعداد البديل من الديدان المانحة باستخدام GLP-1 (رني)
- من لوحة يشوبهمن LB + 25 ميكروغرام / مل كربنيسيلين تطعيم ثقافة بين عشية وضحاها من 3 مل LB تستكمل مع كربنيسيلين مع مستعمرة واحدة من البكتيريا GLP-1 (رني). احتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- ماصة 15 ميكرولتر من GLP-1 (رني) الثقافة بين عشية وضحاها إلى لوحة NGM 35 مم تستكمل مع 25 ميكروغرام / مل كربنيسيلين وIPTG 1MM. احتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- نقل خمسة L3/L4 الحيوانات إلى لوحات (رني) GLP-1. احتضان لمدة يومين في C. ° 20 ورني استهداف GLP-1 النتائج في ذرية المصابين بعيوب انتشار سلالة الجرثومية. عدم القدرة على تطوير كامل النتائج سلالة الجرثومية في الفضاء غير المأهولة التي تملأ مع السائل خارج الخلية. تعظيم الاستفادة من المواد الغذائية لتوليد ذرية رني أن التقدم إلى سن الرشد دون germlines التكاثري قد يكون من الضروري تبعا.
- وقد أعدت PAL-L (رني) كما هو الحال في لوحات الخطوات 2،1-2،3 إعداد CLR-1 (e1745) بروتوكول دودة أعلاه.
- جعل سولو التبييض جديدةنشوئها (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
- ماصة 10 ميكرولتر من محلول التبييض على لوحة المصنفة (رني) PAL-1. تأكد من وضع قطرات التبييض بعيدا عن بقعة البكتيرية.
- نقل الأجنة عن طريق التقاط 2-10 حامل GLP-1 (رني) البالغين في قطرات التبييض.
- احتضان لمدة أربعة أيام في درجة حرارة 20 º
- اختيار الديدان إلى لوحة 60mm NGM غير المصنف وإتاحة الوقت لمسح البكتيريا من بشرة. (خطوة اختيارية) شطف الديدان في M9 أثناء نقل لوحات NGM.
B2) البديل إعداد الديدان المانحة باستخدام الليزر التذرية سلالة الجرثومية
- خط من البكتيريا التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة للمستعمرات واحد على LB + 25 ميكروغرام / مل لوحات كربنيسيلين. سوف نستخدم PAL-1 البكتيريا الرنا المزدوج الجديلة المنتجة لهذه التظاهرة. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- من لوحة كربنيسيلين مع تطعيم ثقافة 3 مل بين عشية وضحاها في LB تستكمل مع 25 ميكروغرام / مل كربنيسيلين.
- ماصة 15 ميكرولتر من اله الثقافة بين عشية وضحاها من PAL-1 الرنا المزدوج الجديلة، معربا عن البكتيريا على لوحات 35 مم NGM تستكمل مع 25 ميكروغرام / مل كربنيسيلين وIPTG 1MM. السماح ليجف بين عشية وضحاها.
- عزل الحيوانات L1 من لوحات الليزر OP50 القياسية ويجتذ مقدمة سلالة الجرثومية خلايا جسدية Z1 وZ4 باستخدام بروتوكول قياسي 3.
- استرداد الديدان الليزر ذاب على لوحات المذكورة رني PAL-1.
- احتضان لمدة 3 أيام في درجة حرارة 20 º
- اختيار الديدان إلى لوحة NGM نظيفة وإتاحة الوقت لمسح البكتيريا من بشرة. (خطوة اختيارية) شطف الديدان في M9 أثناء نقل لوحات NGM.
إعداد الديدان المستلم
- خط من OP50 لمستعمرات واحدة على لوحات LB. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- من لوحة LB تطعيم ثقافة 3 مل بين عشية وضحاها في LB.
- ماصة 15 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها على 35 لوحات NGM مم. تأكد من لوحة البكتيريا قبالة وسط اللوحة. السماح ليجف (حوالي 20 دقيقة).
- جعل حل التبييض الطازجة (1:1 5M KOH: NaHypochlorite).
- ماصة 10 ميكرولتر من محلول التبييض على لوحة المصنف. تأكد من وضع قطرات التبييض بعيدا عن بقعة البكتيرية.
- نقل الأجنة عن طريق التقاط 2-10 البالغين N2 حامل في قطرات التبييض.
- احتضان لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة 20 º
- الانتقال إلى الديدان نظيفة، لوحة NGM غير المصنف واحتضان عند 20 ° م لمدة لا تقل 30 دقيقة.
3. مصاصة للدماء العزل من السائل خارج الخلية
بروتوكول يلي محددة لحقن مكروي انشاء يتكون من حاقن-PLI بيكو-100، إبرة ثابتة عقدت في مياداة مجهرية، ومرحلة العائمة التي يمكن من خلالها الدودة تراجع في الإبرة. ومع ذلك، فإن تقنية المعمم هو إدراج إبرة حقن مكروي فارغة إلى حيوان المانحة، مع الحفاظ على ما يكفي من الضغط لمنع تدفق شعري في من الزيوت المعدنية قبل الدخول وماجستير الخلويةالبكتيرية في حين اختراق أنسجة الجسم الجدار. بينما يتم تقليل الإبرة هو داخل المانحة الضغط الحيوان للسماح شغل الإبرة من شعري مع السائل خارج الخلية، والتي يمكن بعد ذلك انتقل في الإبرة لدودة المستفيدة وطرد عن طريق زيادة الضغط بما فيه الكفاية. ويمكن أيضا إزالة السوائل عن طريق عمل شعري أن يساعده باستخدام التعبئة، أو الشفط، وظيفة من حاقن-بيكو. وينبغي تعميم هذه التقنية تكون قابلة للتكيف بسهولة مع أنظمة حقن الصغيرة الأخرى التي تسمح السيطرة على ضغط التوازن.
- بدوره على المجهر المقلوب، المجهر تشريح، وبيكو، حاقن (انظر الشكل 1).
- أدر مفتاح محدد من حاقن بيكو لواضحة P، وتحقق من أن قياس الحالي في المبادرة. هذه القراءة، والضغط واضح، هو الضغط المدخلات ويجب أن يكون حوالي 0 رطل لكل بوصة مربعة.
- تحقق من صمام أساسي على النيتروجين منظم خزان للتأكد من أن يتم إغلاق الإخراج (تحويل counterclockwise حتى المقبض واهية).
- فتح الخزان الرئيسي صمام النيتروجين. يجب قياس منظم أقرب خزان N2 الآن قراءة الضغط الداخلي للدبابات.
- زيادة الضغط ببطء من خلال تحويل صمام منظم الأولية اتجاه عقارب الساعة. رصد زيادة الضغط على محقن بيكو، (وهذا هو أكثر دقة من الناتج قراءة ضغط على مقياس المنظم). زيادة الضغط ببطء إلى 100 رطل لكل بوصة مربعة. لا تسمح أن يتجاوز 105 رطل لكل بوصة مربعة.
- عندما وصل إلى 100 رطل تبديل محدد لحقن ف وتعيين ضغط الحقن إلى 30 رطل لكل بوصة مربعة باستخدام مقبض Pinject.
- تبديل مفتاح محدد للتوازن P.
- ضع قطرة 15 ميكرولتر من الزيوت المعدنية على المانحين الخاص بك نظيفة وألواح المستفيدة.
- تغطية الخاص الاغاروز حقن 2٪ في لوحة الزيوت المعدنية.
- تحميل إبرة الخاص micropipette سحبت في حامل ومحاذاتها.
- باستخدام مجهر تشريح، تحميل 1 و 1 المانحة دودة المتلقي بالقرب من بعضها البعض على الاغاروز عالإعلان.
- الديدان موقف باستخدام تضخم منخفضة وتقديم إبرة في الزيوت المعدنية بالقرب من المانحين.
- الانتقال إلى الطاقة العالية وإبرة موقف بالقرب من تجويف pseudocoelomic.
- زيادة الضغط على ميزان حوالي 10 رطل لكل بوصة مربعة. ملاحظة المكونات الزيوت المعدنية في رأس الإبرة.
- دفع دودة في الإبرة لوضع تلميح إبرة في تجويف pseudocoelomic عن طريق تحريك المرحلة.
- ملاحظة قفزة في موقف الزيوت المعدنية في رأس الإبرة.
- تخفيف الضغط التوازن للسماح عمل شعري لملء الإبرة. (ويمكن للمرء أيضا استخدام الدالة التعبئة لتسريع عملية).
- بعد جمع السائل الشريحة الدودة بعيدا عن إبرة.
- التحول إلى طاقة منخفضة التكبير وموضع الإبرة من قبل المتلقي دودة (لا تسمح TIP NEEDLE لمغادرة زيوت معدنية). [بدلا من ذلك، يمكن إزالة الإبرة وصاحب السائل نقلها إلى قطرة في أنبوب microcentrifuge.]
- يعود مرة أخرى الىتضخم عالية وتحرك الإبرة في دودة المستلم عن طريق تحريك المرحلة المجهر.
- مرة واحدة في وضع المتلقي الدودة استخدام الحقن (مجموعة ب 35 رطل لكل بوصة مربعة) وظيفة لحقن السائل pseudocoelomic تم جمعها من الجهات المانحة.
- إزالة الإبرة من دودة المستلم عن طريق تحريك المرحلة المجهر في الاتجاه المعاكس كما هو مستخدم للدخول إلى المتلقي.
- مع خروج الإبرة من دودة، ورفع الإبرة بعيدا عن لوحة الحقن.
- إزالة لوحة الحقن ووضع قطرات من M9 على الديدان لاسترداد.
- ضع قطرة من 10 ميكرولتر على صفيحة M9 الفحص.
- اختيار دودة المتلقي في M9 على لوحة الفحص.
4. يعاير رني نقل المظهري
- السماح لتنمو الديدان تعافى لمدة 24 ساعة في درجة حرارة 20 º
- إزالة البالغين المتلقي، وترك الأجنة وآله تحاك على لوحة. احتضان لوحة لمدة 24 ساعة إضافية في C. ° 20
- كما ذرية نقاطبعد أن فقست لا، ولكن يجري تحاك متحولة ظاهريا، أو أن يكون من النوع البري اليرقات.
تلاحظ
- يتم NGM وسائل الاعلام في 1 لتر دفعات عن طريق إضافة 18 غراما من أجار، 2.5 غرام من bactopeptone، 3 غرام من كلوريد الصوديوم وH 2 O. إضافة شريط تحريك والأوتوكلاف. بعد التعقيم وضع القارورة على طبق من ضجة والسماح لوسائل الإعلام لتبريد إلى 60 ° C مع التحريك. بعد أن يبرد وسائل الإعلام، إضافة 1 مل من الكوليسترول (5 ملغ / مل في الإيثانول)، 1 مل من 1M CaCl 2، 1 مل من 1M MgSO 4، 25 مل من العازلة فوسفات البوتاسيوم (pH6.0). إذا هي لوحات لاستخدامها في استكمال ورني NGM مع 1 مل من 1M IPTG و 1 مل من 25 ملغ / مل بعد كربنيسيلين التبريد إلى 60 ° C. وسكب في لوحات 35 ملم إما (3.5 مل من NGM) أو 60 ملم (8.5 مل من NGM) لوحات بيتري.
- أدلى 2٪ الاغاروز في الماء. تخزينها في الثلاجة. تذوب وجعل منصات في وقت مبكر من اليوم من العزلة السائل pseudocoelomic. جفاف لوحة يجعل دودة الانضمام إلى وسادة،والحد الأدنى من يوم واحد من تجفيف الهواء ضروري لمنصات أن تكون جافة بدرجة كافية. إذا كان منصات الحقن جافة جدا والديدان المانحة الخاص والتجفيف أسرع من يمكنك التلاعب بها يمكنك إضافة الرطوبة إلى منصات إضافية الحقن عن طريق التنفس على لوحة قبل إضافة الزيوت المعدنية. بغض النظر عن القدرة على العمل بسرعة لعزل السوائل pseudocoelomic قبل أن يجف دودة عند الضرورة القصوى.
- نستخدم كربنيسيلين في جميع مراحل إعداد غذائنا رني لتحديد علامة لمقاومة أمبيسيلين. كربنيسيلين هو التناظرية الأمبيسلين والتي هي أكثر استقرارا وأقل النتائج في مستعمرات فضائية من الأمبيسلين.
- نستخدم لوحات رني التي تستكمل مع NGM IPTG 1MM و 25 ميكروغرام / مل كربنيسيلين. ناقلات التغذية رني هي في E. HT115 سلالة بكتيريا التي تعاني من عجز عن نوكلياز محددة الرنا المزدوج الجديلة.
- (خطوة اختيارية) ونجد أنه نظرا ساعة على لوحات غير المصنف NGM المانحة والمتلقية الديدان تقوم بعمل كاف فقدان بشرةالبكتيريا محددة ويتم أن أكثر من لوحات التغذية. هذا غير صحيح وإن كان في الحالات التي يكون فيها الهدف رني في الحيوان المانحة يتداخل مع التنقل (على سبيل المثال UNC-22 (رني)). ولذلك لابد للمساعدة في هذه العملية. للقيام بذلك، ونحن نستخدم شريحة الاكتئاب مع ما يقرب من 50 ميكرولتر من M9. اختيار الديدان في M9 من لوحات التغذية رني، مع التحريك ثم اختيار البلاتين دودة هو معيار كافية لإزالة معظم البكتيريا الملتصقة.
5. ممثل النتائج
عرض النتائج من ممثل لنقل التجريبية لمن السائل خارج الخلية CLR-1 (e1745) الديدان البكتيريا نمت على التعبير عن الرنا المزدوج الجديلة استهداف PAL-1. توفي على سلالة الحيوانات المانحة و / أو عرضت العيوب الزخرفة الخلفي. نحن ثم نقل السوائل خارج الخليةمن هذه الحيوانات إلى جوف عام كاذب من الديدان رني البرية من نوع ساذج. جزء من ذرية اللاحقة من الحيوان المتلقي ثم عرض الظواهر المتوقعة PAL-1 متحولة (الشكل 4). هذا هو على النقيض من نسل الحيوانات المتلقي الذي حصل على السائل خارج الخلية من الحيوانات المانحة نمت على المواد الغذائية سواء البكتيرية أو معيار السيطرة رني البكتيريا ناقلات الذي عرض مستويات الخلفية فقط من الفتك (الشكل 4). بينما ذرية المستفيدين من السوائل خارج الخلية من الحيوانات المانحة تمر رني تظهر زيادة كبيرة في وتيرة الظواهر التي يسببها الرنا المزدوج الجديلة، وانتفاذ ليس قويا كما كان في ذرية الحيوانات المانحة، حيث ما يقرب من 100٪ من الأجنة تموت ذرية كما لم يفقس، و إلا نادرا، والحيوانات تشوهات شديدة يفقس.
الشكل 1. مصاصة للدماء الإعداد حقن عكسي. وFO الإعداد المناسبرا مصاصة للدماء الإعداد حقن مكروي العكس هو مماثل لمستوى C. ايليجانس تلاعب حقن مكروي، وتشمل المجهر تشريح، مجهر مقلوب مع أهداف 10X 40X و، مرحلة المنقولة لتحديد المواقع، ومياداة مجهرية مع حامل إبرة الحقن. بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة أيضا لإعداد مجتذب إبرة حقن الإبر. وهناك حاجة فريدة من نوعها في البروتوكول حقن مكروي عكس لحاقن بيكو الذي يسمح التحكم الدقيق للضغط التوازن (مثل وارنر أدوات PLI-100).
الشكل 2. تعزيز حجم pseudocoelomic. حجم السائل pseudocoelomic المتاحة لعزل غير كافية لفحص في البرية من نوع الحيوانات. ويمكن زيادة حجم بقطع تنظيم التوازن الاسموزي من خلال التحول من درجة حرارة CLR-1 (e1745) الحيوانات، مما أدى إلى تراكم السوائل واضحة pseudocoelomic (السهم الأبيض). بالإضافة إلى ذلك الخسارة من الغدة التناسلية قبل الاقتلاع بالليزر أو GLP-1 (رني) تمكن من الوصول إلى السائل خارج الخلية (ويرد الخسارة الاقتلاع بالليزر). هو الأكثر بسهولة لاحظت بقع السائل المتاحة واضحة بين الأمعاء وجدار الظلام الجسم (السهم الأسود)، على الرغم من أن إجمالي حجم المتاح هو أقل بكثير من تلك الموجودة في CLR-1 (e1745) الحيوانات نمت في درجة الحرارة تقييدا.
العزلة الرقم مصاصة للدماء 3. ونقل زمني البروتوكول. أربعة أيام قبل نقلها تجربة عزل CLR-1 (e1745) الأجنة المانحة على لوحات مع الطعام واحتضان رني في C. ° 20 قبل ثلاثة أيام عزل الأجنة المتلقي N2 على OP50. في يوم التجربة تحويل لوحات المانحة إلى 25 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. إزالة الجهات المانحة بعد 25 ° C الحضانة لوحات نظيفة تفتقر إلى الغذاء وتحول إلى 20 ° C. نقل الحيوانات المتلقية لتنظيف لوحاتالتي تفتقر إلى الغذاء والاستمرار في احتضان C. ° 20 أداء تجربة ونقل الديدان استرداد المتلقي على لوحات واحتضان OP50 في C. ° 20 إزالة الحيوانات المتلقي بعد 24 ساعة في درجة حرارة 20 º احتضان ذرية المتلقي لمدة 24 ساعة في درجة حرارة 20 º ذرية نقاط ومتحولة، من النوع البري، أو لم يفقس.
الشكل 4. نتائج الممثل. وفقدان وظائف PAL-1 في المتلقي يؤدي إلى الفتك الجنينية، أو فقدان مميزة التنمية الخلفي (A). وسجل بعد 48 ساعة ذرية نقل PCF وضعت خلال ال 24 ساعة الأولى وإما يرقات من النوع البري، يرقات PAL-1، أو أجنة لم يفقس. يتم الجمع بين وتيرة أجنة لم يفقس وظاهريا PAL-1 اليرقات لإعطاء قدر من PAL-1 (رني) الظواهر التي يسببها نقل. تلقي السوائل pseudocoelomic من الحيوانات نمت على PAL-1 الغذاء الرنا المزدوج الجديلة تنتج تحريض قوية من يرتبط بهاالغيب في متلقي نقل السيطرة (B) الظواهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدمنا هنا طريقة جديدة تمكن من العزلة وتوصيف السائل خارج الخلية من النموذج الحي C. ايليجانس. تقنية يبدأ التلاعب الجيني أو المادية من الديدان المانحة على زيادة حجمها الإجمالي من السوائل خارج الخلية. ثم يتم عزل السوائل خارج الخلية باستخدام تقنية حقن مكروي تعديل. هي التي شنت على الديدان لحقن مكروي باستخدام منصات الجافة الاغاروز لعقد الديدان لا تزال أثناء العملية. المرفق المادية إلى لوحة يستخدم قوة التجفيف لوحة جافة لعقد hydrostatically الدودة في المكان. هذا يمثل تحديا، لأنه بمجرد يتم تحميل دودة المياه المتوفرة خارج الخلية يبدأ لشفط المياه من الحيوانات المانحة. ولذا فمن الضروري أن تعمل بسرعة. قد يكون من المفيد لبعض المجربون تعليق الديدان في الزيوت المعدنية على لوحة الحقن، ولكن لم يكن لهم اجراء اتصالات مع لوحة. بعد تصاعد لوحة الحقن على الالمجهر الإلكتروني، والتوفيق بين الدودة وإبرة انتظر دودة لاجراء اتصالات مع لوحة، وأنها "جبل" في حد ذاته. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أنه قد يكون من الممكن وضع الديدان جسديا على منصات أجار خلال حقن مكروي العادية، نجد أن القوة البدنية لتحميل تطبيق الديدان يمكن أن تسرع إلى حد كبير تجفيف الديدان المانحة. فمن الأفضل لالتقاط الديدان المانحة في الزيوت المعدنية، وتحويلها إلى لوحة عن طريق وضع الطرف المعول بالقرب من منصة والسماح للدودة لتسلق الخروج من اختيار من تلقاء نفسها.
بالإضافة إلى العمل بسرعة، من الضروري أيضا لأداء تقنية العزل مصاصة للدماء نظيفة لتجنب العدوى. إدخال البكتيريا عادة حميدة داخل بشرة يؤدي إلى الإصابة المستمرة والمميتة. الأسلوب السليم يقضي على حدوث عدوى. يمكن للمرء اختبار على نظافة نقل السوائل خارج الخلية باستخدام البكتيريا التي تم تحديدها بسهولة. عند وضع هذه التقنية وجدنا أنه beneficial لممارسة مع سلالات البكتيرية التي يمكن أن تتبعها مضان 4، 5. إذا التلوث الجرثومي يدخل دودة المانحة لوحظ بسهولة في غضون 24 ساعة من الإصابة.
نجد أن الديدان المتلقي تظهر النمط الظاهري أضعف رني من الديدان المانحة. هذا ليس من المستغرب كما تزرع الديدان المانحة على البكتيريا توليد مصدرا دائما للالرنا المزدوج الجديلة، في حين أن المستفيدين من نقل السوائل pseudocoelomic يحصلون على جرعة واحدة بتركيزات الفسيولوجية طبيعية. ولذلك فمن الضروري النظر في الحد من الحساسية وتحقيق أقصى قدر من قوة رني في الجهة المانحة. استخدام IPTG للحث على إنتاج الرنا المزدوج الجديلة لا تتصرف بطريقة يمكن التنبؤ بها مع أكثر تحريض يعادل رني أكثر كفاءة. نشير القراء على توصيف نشرت الكفاءة البيئية رني (انظر 6،7،8). نقترح أن أحد يحدد تجريبيا الأسلوب الأكثر فعالية من التسليم إلى العلاقات العامة المانحةIOR إلى عزل السوائل خارج الخلية لتحليلها.
لقد أظهرنا أنه يمكن الكشف عن إشارات النظامية إسكات رني من الرنا المزدوج الجديلة بنك الاحتياطي الفيدرالي في السائل خارج الخلية. أظهرت توصيف هذه الإشارات أن تحديد وتحليل السائل خارج الخلية الوراثية هو ممكن. على الرغم من أننا تستخدم في المقام الأول لوصف التحليل الجيني هذه الإشارات خارج الخلية، ينبغي أن يكون من الممكن أيضا لإجراء تحليل السائل خارج الخلية الجزيئية لل. ويمكن علاج إزالة السوائل، إما كيميائيا أو إنزيمي، قبل نقلها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن جمع السائل من الحيوانات متعددة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة لفحص الجزيئية. تجميع المواد من الجهات المانحة متعددة لنقل في متبرع واحد من الصعب، على الرغم من قد يكون ممكنا مع الممارسة. مع الصقل والتكيف نتوقع التطبيقات المستقبلية تسير على ما يرام بعد توصيف المزيد من رني حمل إشارات خارج الخلية. تحديد وتوصيفقد يشير الرناوات الذاتية النظامية، والتحليل الجيني للمسارات الإشارات بين الخلايا التنموية، والتغيرات التي يسببها للبيئة في تكوين خارج الخلية يكون ممكنا من خلال تكييف هذه التقنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعترف الطبيعة التعاونية للمختبر هنتر، وأشكرهم على مناقشة مفيدة والمساعدة التي جعلت تطوير هذه التقنية ممكن والمرح. نود أن نشكر نايجل ديلاني وعلم الوراثة Caenorhabditis مركز دودة وسلالات بكتيرية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM089795 منحة لCPH.
References
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Genetics. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e, Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
