Summary
Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Reporter-Assay schnell zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Selbst-Erneuerung zu regulieren.
Abstract
Pluripotenz und Selbsterneuerung sind zwei definierenden Eigenschaften von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen). Das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismus wird dadurch wesentlich erleichtert den Einsatz von ES-Zellen für Entwicklungsbiologie Studien, Krankheit Modellierung, der Wirkstoffforschung und in der regenerativen Medizin (Übersicht in 1,2).
Um die Identifizierung und Charakterisierung neuer Regulatoren der ES-Zell-Wartungs-und Selbst-Erneuerung beschleunigen, entwickelten wir eine Fluoreszenz-Reporter-basierter Assay zur quantitativen Messung der Selbst-Erneuerung Status in Maus-ES-Zellen unter Verwendung des Oct4GiP Zellen 3. Die Oct4GiP Zellen exprimieren das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Oct4-Gen Promotor-Region 4,5. Oct4 ist für ES-Zell-Selbsterneuerung benötigt, und ist stark in ES-Zellen exprimiert und schnell herunter reguliert während der Differenzierung 6,7. Als ein Ergebnis korreliert GFP-Expression und Fluoreszenz in den Reporter-Zellen treumit dem ES-Zell-Identität 5 und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Analyse kann verwendet werden, die sorgfältige Überwachung der Selbst-Erneuerung Status der Zellen auf der Ebene der Einzelzelle 3,8 sein.
Gekoppelt mit RNAi, kann die Oct4GiP Reporter Assay verwendet, um schnell zu identifizieren und zu untersuchen Regulatoren der ES-Zell-Wartungs-und Selbst-Erneuerung 3,8 sein. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Bestimmung von Selbst-Erneuerung, ist es bequemer, einfühlsam, quantitative und von geringeren Kosten. Es kann in 96 durchgeführt werden - oder 384-Well-Platten für eine groß angelegte Studien wie High-Throughput-Screens oder genetische Analyse Epistasie. Schließlich wird unter Verwendung anderen Linie-spezifischen Reporters ES-Zelllinien, kann der Assay hier beschriebenen auch modifiziert werden, Determination während der ES-Zelldifferenzierung zu untersuchen.
Protocol
1. Oct4GiP Maus-ES-Zell-Wartung
Oct4GiP Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Austin Smith zur Verfügung gestellt. Sie wurden von den Mäusen, die eine 129/Ola Oct4-Transgen GFPiresPac 4,5 abgeleitet. Sie werden in mit Gelatine beschichteten Gewebekulturplatten in der Esgro komplette plus klonale Grad Medium (Millipore), oder in der M15-Medium: DMEM (Invitrogen) mit 15% FBS, 1000 U / ml Esgro (Millipore), 1x Nicht-ergänzt essentiellen Aminosäuren (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore) und 10 &mgr; M β-Mercaptoethanol.
- Mantel-Platten mit 0,1% Gelatine (Sigma) bei Raumtemperatur für 30 Minuten (0,1 ml Gelatinelösung / cm 2).
- Tafel Oct4GiP Zellen in mit Gelatine beschichteten Platten bei ~ 2 x 10 4 / cm 2.
- Teilen Sie die Zellen alle zwei Tage mit 0,05% Trypsin.
2. siRNA Transfektion in Oct4GiP Cells
Die Oct4GiP Reporter-Assay ist am convenienoder 384-Well-Platten (Corning oder BD) in der M15 Medium - TLY in Gelatine beschichtete Flachboden-96 durchgeführt. Der gesamte Vorgang ist in Abbildung 1 dargestellt.
- siRNA-Lipid-Komplexen Montage:
- Für die Transfektion in 96-well Platten, montieren siRNA-Lipid-Komplexen in U-Boden 96-well Platten.
- In jede Vertiefung, mischen 10 pl OptiMEM (Invitrogen) und 0,3 ul Lipofectamin 2000 (Invitrogen) und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.
- In 5 pmol siRNA an die Lipid-OptiMEM Mischung und Inkubation für weitere 15 Minuten. Die siRNA: Lipid-Verhältnis ist 100 pmol: 6UL.
- Übertragen Sie die siRNA-Lipid-Komplexen in OptiMEM aus der U-Bodenplatte zur Gelatine beschichtete Flachboden-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette.
- Für die Transfektion in 384-Well Platten, bereiten Sie die siRNA-Lipid-Komplexen mit 0,1 pl Lipofectamin 2000 und 2 pmol siRNA in 10 ul OptiMEM.
Hinweis: Die endgültige siRNA-Konzentration inDie Transfektionen beträgt 50 Nm. Führen Sie 3-4 biologischen Wiederholungen für jede siRNA-Transfektion. Richten Sie Master Mischungen der siRNA-Lipid-Komplexen in der U-Bodenplatte und Aliquot in die Flachboden-Gelatine beschichtete Platte.
- Oct4GiP Zelle Plating und Transfektion:
- Für die Transfektion in 96-well Platten, sammeln die Oct4GiP Zellen resuspendieren und sie in frischem Medium M15 bis 9 x 10 4 Zellen / ml.
- Geben Sie 100 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette.
- Mischen der Zellsuspension mit dem Standard-aliquotierte siRNA-Komplexe Lipide in der Vertiefung durch Pipettieren nach oben und unten 3-5 mal. Ändern Sie Tipps für die verschiedenen siRNA Transfektionen.
- Für die Transfektion in 384-Well-Platten, resuspendieren Oct4GiP Zellen zu 6 x 10 4 Zellen / ml und 30 ul Aliquot Zellsuspension in jede Vertiefung.
Hinweis: Die optimale Zell-Beschichtungs-Dichte ist in der Regel 3 x 10 5 Zellen / cm 2, aber es may erfordern eine weitere Optimierung für siRNAs, die einen dramatischen Einfluss auf das Zellwachstum oder die Lebensfähigkeit. Niedrige Plattierungsdichte kann zu einer schlechten Überleben der Zellen während der Transfektion führen. Hohe Beschichtungs-Dichte führt zu hohen Hintergrund durch hohe Zellkonfluenz induzierte Differenzierung führen. Wenn nötig, Test Beschichtungs-Dichte zwischen 2-4 x 10 5 Zellen / cm 2.
- Mittlere Veränderung:
- Entfernen Sie alte Medium unter Verwendung von Multi-Channel-Aspirator (Corning) oder Vakuum-Zauberstab (VP-Scientific). Achten Sie darauf, um die Zellen an der Unterseite der Platten zu kratzen.
- Führen Sie die Zellen mit frischem ES-Zell-Medium (100 ul für 96-Well-Platte und 30 ul für 384-Well-Platte) mit Mehrkanal-Pipette jeden Tag.
3. FACS-Analyse
- Zelldissoziation:
- Vier Tage nach der Transfektion zu entfernen Medium mit Mehrkanal-Saugvorrichtung (Corning) oder Vakuum-Stab (VP-Scientific).
- Für 96-well Platten, spülen Sie die Zellen einmal mit 100μl PBS.
- In 25 ul 0,25% Trypsin in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten unter gelegentlichem Schütteln, und die Inaugenscheinnahme zur vollständigen Ablösung der Zellen zu gewährleisten.
- In 90 ul PBS mit 10% FBS, um das Trypsin zu inaktivieren und distanzieren Zellen zu einer einzigen Zellsuspension durch wiederholtes Pipettieren.
- Für 384-well Platten, distanzieren Zellen mit 10 ul Trypsin und Quench mit 30 ul PBS mit 10% FBS.
- FACS-Analyse:
- Analysieren Sie die GFP-Fluoreszenz auf der BD LSRII FACS-Analyzer mit dem HTS-Gerät oder einen anderen ähnlich ausgestatteten FACS-Analyser (wie Accuri oder Intellicyt) ausgestattet.
- Verwenden Sie das High-Throughput-Modus auf der HTS und analysieren 10 ul Zellsuspension. Sie können die Anzahl Schwellenwert bis 1,0 x 10 4 Zellen.
- Passen PMT-Spannung und Schwelle, um die Zellen in der Vorwärts-vs-Seite Streudiagramm zu erfassen. Tor für die Live-Zell-Population in der vorwARD vs side-Streudiagramm.
- Erstellen Sie ein Histogramm Plot für die GFP-Kanal. Sie das Tor in der GFP-Kanal, so dass ~ 10% der Zellen zu sein GFP-negativen in den mock-Steuerelement oder-siRNA transfizierten Zellen zu sehen.
- Bestimmen% GFP-negativen Zellen aus jeder Behandlung: Differenzierte Zellen% =% GFP-negativen Zellen. Vergleichen Sie die% Differenzierte Zellen zwischen Experimental-und Kontroll-siRNA-Transfektionen mit 2-tailed t-Test, und erreichen Sie die positive Treffer mit p-Werte <0,01.
4. Repräsentative Ergebnisse
Oct4, Nanog und Sox2 sind drei Gene, die eine entscheidende Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung der ES-Zell-Selbsterneuerung 6,7,9-11. Abbildung 2 zeigt, dass die Oct4GiP Reporter-Assay leicht erkennen kann, die Differenzierung durch Schweigen zu dieser Faktoren in der verursachte Oct4GiP ES-Zellen.
2A zeigt die Oct4GiP ES-Zellen sind GFP-positive, wenn sie als ES beibehalten Zellen. 2B zeigt die Seite nach vorne vs Streudiagramm und das Histogramm des GFP-Kanal der Oct4GiP Zellen mit dem Kontroll-oder Oct4-siRNAs transfiziert. Es ist notwendig, Gate für lebende Zellen in der vorderen Seite vs Streudiagramm, wie die toten Zellen und Zelltrümmer zu GFP-negativ sind und Hintergrund zu erhöhen. Auf der anderen Seite, Wams, um mögliche Diskriminierungen Zellklumpen auszuschließen ist nicht immer erforderlich. In den Kontroll-siRNA transfizierten Zellen sollte die überwiegende Mehrheit der Zellen zu sein GFP-positiven. Wenn offensichtlich GFP-negativen Populationen in den Kontroll-siRNA transfiziert Brunnen sind, können die Start Oct4GiP Zellen oder die Transfektion Verfahren kompromittiert worden sind und das Ergebnis kann nicht interpretiert werden.
2C zeigt die Balkenanzeige von% Differenzierte Zellen (% Differenzierte Zellen =% GFP-negativen Zellen) von Kontroll-, Oct4-, Nanog-und Sox2-siRNA transfizierten Zellen.
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Abbildung 1. Gliederung des Oct4GiP Reporter-Assay.
Abbildung 2. Oct4GiP Reporter-Assay kann erkennen, ES-Zell-Differenzierung durch Nanog, Oct4, Sox2 oder Silencing verursacht. A) E14Tg2a (Wild-Typ, schwarze Linie) und Oct4GiP (grüne Linie) Zellen wurden durch FACS analysiert. Histogramm der GFP-Kanal zeigt, dass Oct4GiP Zellen GFP-positiv sind. B) Oct4GiP Zellen wurden in 96-well Platten mit dem Control-oder Oct4-siRNA transfiziert und FACS analysiert 4 Tage nach der Transfektion. Vorwärts vs Seite Streudiagramme und Histogramme des GFP-Kanal der transfizierten Zellen gezeigt werden. C) Oct4GiP Zellen wurden mit der Steuer-, Nanog-, Oct4-oder siRNA-Sox2. Die% differenzierten Zellen vom% GFP-negativen Zellen 4 Tage nach der Transfektion bestimmt und wurde aufgetragen als Mittelwert + / - Standardfehler des Mittelwertes (n = 4).f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Oct4GiP Reporter-Assay beschreiben wir oben kann quantitativ messen das Ausmaß der Selbst-Erneuerung vs Differenzierung. Im Vergleich zu anderen verfügbaren Verfahren, wie die Morphologie-basierten 12 und Proliferation / Lebensfähigkeit-basierten Assays, bietet eine höhere Empfindlichkeit und Durchsatz sowie eine direkte Messung der ES-Zelle Zustand. Es wird daher auch für große Bildschirme und genetische Analyse Epistasie geeignet. In der Tat haben wir und andere erfolgreich das Oct4GiP Reporter-Assay für genomweite RNAi-Screens 3,8 verwendet. Wie alle Assays, aber es hat auch Einschränkungen. Es kann nur verwendet werden, um Gene, die direkt oder indirekt regulieren Oct4 Promotoraktivität zu untersuchen, und es kann fälschlich Gene, die GFP-Expression, Stabilität oder Funktion posttranskriptional beeinflussen. Daher sind weitere Tests oder sekundären Screenings, wie zB alkalische Phosphatase-Färbung 13 (Millipore, SCR004) und Immunfluoreszenzfärbung oder quantitative RT-PCR von Markern für Pluripotenz 3,8,12,14 sind erforderlich, um Ergebnisse aus diesem Verfahren bestätigt werden können.
Die Oct4GiP Reporter-Assay stützt sich auf eine effiziente Gen-Silencing. Effektive und effiziente siRNAs siRNA Transfektionen sind der Schlüssel zum Erfolg des Assays. Obwohl wir beschrieben nur die Benutzung des Reporter-Assay mit siRNA Transfektionen, kann der Assay auch mit DNA-Transfektionen zu schweigen oder überexprimieren Gene von Interesse durchgeführt werden. DNA Transfektionseffizienz ist normalerweise kleiner als die von siRNAs und kann die Stärke des Phänotyps zu reduzieren.
Außer dem, was in diesem Protokoll beschrieben, kann die Oct4GiP Reporter-Assay für die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die negativ regulieren Selbsterneuerung ebenfalls geändert werden. In diesem Fall können die Zellen mit siRNAs transfiziert werden und kultiviert in Differenzierungsbedingungen. Silencing von negativen Regulatoren der Selbst-Erneuerung wird erhöhen sich selbst zu erneuern und zu erhalten GFP-Expression, was sein kann dmpfangsposition Laserstrahl durch FACS ähnlich wie in dem aktuellen Protokoll beschrieben.
Neben den Oct4GiP Reporterzellen, haben andere Reporter-Zelllinien unter Verwendung von ES-Zell-spezifische Promotoren, wie der Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) und Rex1-GFP 19-Zellen, auch erzeugt. Sie können auch verwendet werden, um ES-Zell-Selbsterneuerung und Wartung der gleichen Strategie zu studieren. Allerdings, denn es gibt deutliche Unterschiede in der Aktivität und Spezifität dieser ES-Zell-Marker-Gen-Promotoren, verhalten sich diese Reporter-Zelllinien unterschiedlich in Bezug auf Hintergrund Ebene und Sensibilität und somit gegenseitig ergänzen. Schließlich durch die Verwendung anderer Abstammung-spezifischen Reporter ES-Zelllinien, können unsere Strategie geändert, um das Schicksal-Spezifikation von ES-Zellen zu studieren und erleichtern die Nutzung von ES-Zellen als in vitro Modell zur frühen Entwicklung von Säugetieren werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Brad Lackford zum Lesen und Editieren des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Research Program Intramural Z01ES102745 (GH) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
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