Summary
Vi beskriver en fluorescens reporter analyse for å raskt identifisere og karakterisere gener som regulerer mus embryonale stamceller vedlikehold og selvfornyelse.
Abstract
Pluripotency og selvfornyelse er to definerende karakteristikkene av embryonale stamceller (ES-celler). Forstå den underliggende molekylære mekanismen vil i stor grad forenkle bruken av ES celler for utviklingsbiologi studier, sykdom modellering, drug discovery, og regenerativ medisin (anmeldt i 1,2).
For å påskynde identifisering og karakterisering av nye regulatorer av ES celle vedlikehold og selvfornyelse, utviklet vi en fluorescens reporter-baserte analysen til kvantitativt måle selvfornyelse status i mus ES celler ved hjelp av Oct4GiP cellene tre. De Oct4GiP celler uttrykker den grønne fluorescerende protein (GFP) under kontroll av Oct4 genet promoter-regionen 4,5. Oct4 kreves for ES celle selvfornyelse, og er høyt uttrykt i ES cellene og raskt nedregulert i løpet differensiering 6,7. Som et resultat, korrelerer GFP uttrykk og fluorescens i reporteren cellene trofastmed ES cellen identitet 5, og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse kan brukes til å nøye overvåke selvfornyelse status av cellene på celle-nivå 3,8.
Sammen med RNAi, kan Oct4GiP reporteren analysen brukes til å raskt identifisere og studere regulering av ES celle vedlikehold og selvfornyelse 3,8. Sammenlignet med andre metoder for å analysere selvfornyelse, er det mer praktisk, følsom, kvantitativ, og av lavere kostnader. Det kan utføres i 96 - eller 384-brønnen plater for store studier som high-throughput skjermer eller genetisk epistasis analyse. Til slutt, ved hjelp av andre slektslinje-spesifikke reporter ES cellelinjer, kan analysen vi beskriver her også bli modifisert for å studere skjebnen spesifikasjonen under ES celledifferensiering.
Protocol
1. Oct4GiP Mouse ES Cell Maintenance
Oct4GiP celler ble vennlig levert av Dr. Austin Smith. De ble utledet fra de 129/Ola mus som frakter en Oct4-GFPiresPac transgenet 4,5. De er opprettholdt i gelatin-belagte vevskulturstudier plater i ESGRO komplett pluss klonal klasse medium (Millipore), eller i M15 medium: DMEM (Invitrogen) supplert med 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x Ikke- essensielle aminosyrer (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), og 10 mm β-mercaptoethanol.
- Coat plater med 0,1% gelatin (Sigma) ved romtemperatur i 30 minutter (0,1 ml gelatin løsning / cm 2).
- Plate Oct4GiP celler i gelatin-belagte plater på ~ 2 x 10 4 / cm 2.
- Split cellene annenhver dag med 0,05% trypsin.
2. siRNA Transfeksjon i Oct4GiP celler
Den Oct4GiP reporter analysen er mest conveniently utført i gelatin-belagt flat bunn 96 - eller 384-brønnen plater (Corning eller BD) i M15 medium. Den generelle prosedyren er skissert i figur 1.
- siRNA-lipid komplekser montering:
- For transfeksjon i 96-brønners plater, montere siRNA-lipid komplekser i U-bunn 96-brønns plater.
- I hver brønn, blande 10 mL OptiMEM (Invitrogen) og 0,3 mL Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Tilsett 5 pmol siRNA til lipid-OptiMEM blanding og inkuber i ytterligere 15 minutter. SiRNA: lipid ratio er 100 pmol: 6ul.
- Overfør siRNA-lipid komplekser i OptiMEM fra U-bunnplaten til gelatin-belagt flat bunn plate med en flerkanals pipette.
- For transfeksjon i 384-brønns plater, forberede siRNA-lipid komplekser med 0,1 mL Lipofectamine 2000 og 2 pmol siRNA i 10 mL OptiMEM.
Merknad: Den endelige siRNA konsentrasjon ide transfections er 50 Nm. Gjennomfør 3-4 biologisk replikater for hver siRNA transfeksjon. Sett opp master-blandinger av siRNA-lipid komplekser i U-bunnplaten og delmengde inn i flat-bunn gelatin-belagt plate.
- Oct4GiP celle plating og transfeksjon:
- For transfeksjon i 96-brønners plater, samle Oct4GiP cellene og resuspender dem i frisk M15 medium til 9 x 10 4 celler / ml.
- Tilsett 100 mL av cellesuspensjon i hver brønn med en flerkanals pipette.
- Bland cellesuspensjon med pre-alikvoteres siRNA-lipider komplekser i brønnen ved pipeting opp og ned 3-5 ganger. Endre tips for ulike siRNA transfections.
- For Transfeksjon i 384-brønns plater, Resuspender Oct4GiP celler til 6 x 10 4 celler / ml og delmengde 30 mL cellesuspensjon til hver brønn.
Merk: Den optimale celle platekledning tetthet er vanligvis 3 x 10 5 celler / cm 2, men det may kreve ytterligere optimalisering for siRNAs som dramatisk påvirker cellevekst eller levedyktighet. Lav plating tetthet vil føre til dårlig celle overlevelse under transfeksjon. Høy plating tetthet vil føre til høy bakgrunn på grunn av høy celle samløpet indusert differensiering. Om nødvendig, test plating tetthet mellom 2-4 x 10 5 celler / cm 2.
- Medium endring:
- Fjern gammel medium ved hjelp av multi-kanal vifte (Corning) eller vakuum tryllestav (VP-Scientific). Vær forsiktig så du ikke riper opp cellene i bunnen av platene.
- Mate cellene med fersk ES celle medium (100 mL for 96-brønn plate og 30 mL for 384-brønn plate) med multikanals pipette hver dag.
3. FACS Analyse
- Cell dissosiasjon:
- Fire dager etter transfeksjon, fjerner medium ved hjelp av multi-kanal vifte (Corning) eller vakuum tryllestav (VP-Scientific).
- For 96-brønns plater, skyll celler gang med 100μl PBS.
- Tilsett 25 mL 0,25% trypsin i hver brønn med en flerkanals pipette.
- Inkuber ved romtemperatur for 5minutes med sporadisk uro, og visuelt inspisere for å sikre fullstendig avløsning av cellene.
- Legg 90 mL PBS med 10% FBS til inaktivere trypsin og dissosierer celler i en enkelt celle suspensjon av gjentatt pipettering.
- For 384-brønns plater, angre celler med 10 mL trypsin og slukke med 30 mL PBS med 10% FBS.
- FACS analyse:
- Analyser GFP fluorescens på BD LSRII FACS analysator utstyrt med HTS enheten eller annen tilsvarende utstyrt FACS analysator (som Accuri eller Intellicyt).
- Bruk høy gjennomstrømning modus på HTS og analysere 10 mL av cellesuspensjon. Sett teller terskelen til 1,0 x 10 4 celler.
- Juster PMT spenning og terskelen for å fange cellene i fremre kontra side-spredningsdiagram. Gate for levende celle befolkningen i forwArd vs side-spredningsdiagram.
- Lag et histogram tomt for GFP kanalen. Sett gate i GFP kanalen slik at ~ 10% av cellene synes å være GFP-negativ i modellvaksinen eller kontroll-siRNA transfekterte celler.
- Bestem% GFP-negative celler fra hver behandling:% differensierte celler =% GFP-negative celler. Sammenlign% differensierte celler mellom eksperimentelle-og kontroll-siRNA transfections med 2-tailed T-test, og scorer de positive treff med p-verdier <0,01.
4. Representative Resultater
Oct4, Nanog, og Sox2 er tre gener som spiller avgjørende roller i vedlikehold av ES celle selvfornyelse 6,7,9-11. Figur 2 viser at Oct4GiP reporteren analysen kan lett oppdage differensiering forårsaket av stanse disse faktorene i Oct4GiP ES celler.
Figur 2a viser Oct4GiP ES celler er GFP-positive når opprettholdes som ES celler. Figur 2B viser frem vs side spredningsdiagram og histogram av GFP kanalen av Oct4GiP cellene transfekterte med kontroll-eller Oct4-siRNAs. Det er nødvendig å gate for levende celler i terminmarkedet vs side spredningsdiagram, som døde celler og rusk er GFP-negativ og vil øke bakgrunn. På den annen side, Doublet diskriminering å utelukke mulige celle klumper er ikke alltid nødvendig. I kontroll-siRNA transfekterte celler, bør de aller fleste cellene være GFP-positive. Hvis åpenbare GFP-negative populasjoner er tilstede i kontroll-siRNA transfekterte brønner, kan start Oct4GiP celler eller transfeksjon prosedyren har blitt kompromittert og resultatet kan ikke være tolkbare.
Figur 2C viser søylediagrammet av% differensierte celler (% differensierte celler =% GFP-negative celler) fra kontroll-, Oct4-, Nanog-og Sox2-siRNA transfekterte celler.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
Figur 1. Omriss av Oct4GiP reporteren analysen.
Figur 2. Oct4GiP reporter analyse kan påvise ES celledifferensiering forårsaket av Nanog, Oct4, eller Sox2 stanse. A) E14Tg2a (vill-type, sort linje) og Oct4GiP (grønn linje) celler ble analysert ved FACS. Histogram av GFP-kanalen viser at Oct4GiP celler er GFP-positive. B) Oct4GiP celler ble tilført i 96-brønners plater med Control-eller Oct4-siRNA og FACS analysert 4 dager etter transfeksjon. Videresend vs side spredningsplott og histogrammer av GFP-kanal i det transfekterte cellene er vist. C) Oct4GiP celler ble tilført med Control-, Nanog-, Oct4-eller Sox2-siRNA. Den% differensierte celler ble bestemt fra% GFP-negative celler 4 dager etter transfeksjon, og ble plottet som betyr + / - standard feil for gjennomsnittet (n = 4).f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovenfor kan kvantitativt måle omfanget av selvfornyelse vs differensiering. Sammenlignet med andre tilgjengelige metoder, for eksempel morfologi-baserte 12 og spredning / levedyktighet-baserte analyser, tilbyr høyere følsomhet og gjennomstrømning, samt en mer direkte måling av ES cellen staten. Det er derfor godt egnet for storskala-skjermer og genetisk epistasis analyse. Faktisk har vi og andre med hell brukt den Oct4GiP reporter analysen for genom-wide RNAi skjermer 3,8. Som alle analyser, men det har også begrensninger. Den kan bare brukes til å studere gener som direkte eller indirekte regulerer Oct4 promoter aktivitet, og det kan feilaktig identifisere gener som påvirker GFP uttrykk, stabilitet eller funksjon etter transcriptionally. Derfor ytterligere analyser eller sekundære skjermer, for eksempel alkalisk fosfatase farging 13 (Millipore, SCR004) og immunfluorescens flekker eller kvantitativ RT-PCR av pluripotency markører 3,8,12,14 er pålagt å bekrefte resultatene fra denne metoden.
Den Oct4GiP reporter analysen baserer seg på effektiv genet Silencing. Effektive siRNAs og effektive siRNA transfections er nøkkelen til suksess for analysen. Selv om vi bare beskrevet bruk av reporteren analysen med siRNA transfections, kan analysen også utføres med DNA transfections til taushet eller overuttrykker gener av interesse. DNA transfeksjon effektivitet er vanligvis lavere enn siRNAs og kan redusere styrken på fenotype.
Foruten det som ble beskrevet i denne protokollen, kan Oct4GiP reporteren analysen endres for å identifisere og karakterisere gener som negativt regulerer selvfornyelse også. I så fall kan cellene bli tilført med siRNAs og dyrket i differensiering forhold. Stanse negative regulatorer av selvfornyelse vil styrke selvfornyelse og opprettholde GFP uttrykk, som kan være detected av FACS tilsvarende som beskrevet i gjeldende protokoll.
Foruten de Oct4GiP reporter cellene, har andre reporter cellelinjer med ES-celle spesifikke arrangører, for eksempel Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) og Rex1-GFP 19 celler, også blitt generert. De kan også brukes til å studere ES celle selvfornyelse og vedlikehold med samme strategi. Men fordi det er merkbar forskjell i aktivitet og spesifisitet av disse ES cell markørgen arrangører, disse reporter cellelinjene oppføre seg annerledes når det gjelder bakgrunn nivå og følsomhet, og vil dermed utfylle hverandre. Til slutt, ved hjelp av andre slektslinje-spesifikke reporter ES cellelinjer, kan vår strategi endres til å studere skjebnen-spesifikasjon av ES celler og lette bruken av ES celler som en in vitro modell for pattedyr tidlig utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Brad Lackford for lesing og redigering av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health egenutført Research Program Z01ES102745 (til GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
