In Ovo Electroporations van HH Stage 10 kippenembryo's

Summary

Kuiken in ovo electroporatie is een techniek die genetische manipulatie van de aviaire embryo mogelijk maakt. Voorkomende toepassingen van deze techniek zijn functionele analyse van genen en vermeende enhancer elementen. Deze video toont neurale buis elektroporatie in HH 10 kippenembryo's. Injectietechniek en de juiste eierbehandeling worden besproken.

Abstract

Groot formaat en externe ontwikkeling van het kippenembryo al lang het tot een waardevol hulpmiddel in de studie van de ontwikkelingsbiologie. Met de komst van moleculair biologische technieken, is het kuiken uitgegroeid tot een nuttig systeem om genregulatie en functie te bestuderen. Door electroporating DNA of RNA-constructen in de zich ontwikkelende kippenembryo, kunnen genen worden uitgedrukt of neergeslagen om te analyseren in vivo genfunctie. Op dezelfde manier kan reporter constructen gebruikt worden voor het lot in kaart brengen of naar vermeende gen-regulatorische elementen te onderzoeken. In vergelijking met soortgelijke experimenten in de muis, kuiken elektroporatie heeft als voordeel dat het snel, eenvoudig en goedkoop. Deze video toont eerst hoe een venster te maken in de eierschaal om het embryo te manipuleren. Vervolgens wordt het embryo wordt gevisualiseerd met een verdunde oplossing van Oost-Indische inkt ingespoten onder het embryo. Een glazen naald en pipet worden gebruikt om DNA en snel groen kleurstof te injecteren in de zich ontwikkelende neurale buis, dan platina elektroden worden parallel geplaatst om het embryo en korte elektrische pulsen worden toegediend met een pulsgenerator. Tot slot wordt het ei afgesloten met tape en teruggeplaatst in een incubator voor verdere ontwikkeling. Daarnaast is de video is te zien juiste ei opslag en handling en bespreekt mogelijke oorzaken van embryo verlies na elektroporatie.

Protocol

Eierbehandeling Eieren mogen worden bewaard bij 13 ° C tot een week voorafgaand aan de incubatie zonder een significant verlies van de levensvatbaarheid (een klein wijnkoeler is ideaal voor dit doel). Voorafgaand aan de incubatie, laat de eieren op kamertemperatuur, plaats dan warm in een bevochtigde kip incubator ingesteld op 37,8 ° C (100 ° F). We meestal electroporate embryo's ongeveer 48 uur na het begin van de incubatie, wanneer het embryo heeft Hamburger en Hamilton het podium …

Discussion

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor neurale buis elektroporatie van HH10 kippenembryo's. Naast het tonen van de techniek, is richtlijnen voor de opslag en behandeling van eieren ook voorzien. Deze techniek heeft een breed scala van toepassingen voor genetische analyse, en het gemak en de lage kosten van experimenten maakt ze haalbaar is voor vele labs.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Chicken egg incubator				humidified, set to 37.80°C (100F).
Pulse generator		Genetronics	BTX T820	Square wave generator or comparable
Electrodes				our electrodes were made from 0.25 mm diameter platinum wire and were 5 mm long and spaced 1 mm apart
Connecter cables
Micromanipulator
Dissecting scope				with large working distance
Glass capillaries				and capillary puller or commercial glass needles
Leibovitz’s L-15 media
chicken eggs				fertilized
Curved scissors
10 ml syringe
Large bore needle				16-18G
Mouth pipette
India ink
Insulin syringe/syringe
Plasmid DNA				≥ 1µg/µl in sterile TE or 1X PBS containing 0.05% Fast Green dye